几丁质酶几丁质-结合片段制造技术

本发明专利技术提供了人几丁质酶的几丁质－结合片段、片段类似物、编码所述片段和类似物的纯化和分离的多核苷酸序列，以及用于重组生产人几丁质片段产物的物质和方法，所述片段产物预期可用于检测几丁质，结合几丁质并治疗真菌感染或者开发用于治疗所述疾病的产物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是1998年3月12日申请的美国系列申请09/039,198的接续申请。通过几丁质酶可降解几丁质。在植物、微生物和动物中均发现了几丁质酶。细菌几丁质酶为细菌生长提供了碳源。昆虫产生几丁质酶以便在每次蜕皮时消化其外皮。在植物中，认为几丁质酶提供抵御寄生性真菌的保护作用。已从许多细菌(例如粘质沙雷氏菌，Jones等，EMBO J.，5467-473(1986))、植物(例如烟草，Heitz等，Mol.Gen.Genet.，245246-254(1994))和昆虫(例如黄蜂，Krusgnandeng，生物化学杂志(J.Biol.Chem.，)26920971-20976(1994))中克隆了几丁质酶，并根据序列相似性将其分为两个不同的家族，命名为18家族和19家族(Henrissat和Bairoch，生物化学杂志(Biochem，J.)293781-788)。尽管18家族酶的催化区域在许多种间于很大程度上是保守的，但对于几丁质-结合结构域而言，种间只有很有限的序列相似性。多个家族18几丁质-结合结构域的唯一共有特征是存在多个半胱氨酸残基。已在哺乳动物中鉴定了与细菌、昆虫和植物几丁质酶有较低同源性的蛋白质(低于40％的氨基酸同一性)，例如人软骨gp39(c-gp39)，人糖蛋白YKL-40，来自绵羊的输卵管特异性的雌激素诱导的蛋白质，牛和人；以及来自激活的小鼠巨噬细胞的分泌蛋白。但是，尚未报道这些蛋白质的几丁质降解活性。这些蛋白质的功能是未知的，但是已认为它们与组织的再成型有关。Hakala等(同上文)报道在来自类风湿性关节炎患者的滑液和软骨样品中可检测到C-gp39，但在正常人的所述样品中则检测不到。Recklies等关节炎风湿病(Arthritis Rheumatism)36(9 SUPP L.)S190(1993)报道了C-gp39蛋白在软骨表层不同细胞种群中的位置。Johansen等(同上文)报道YKL-40血清水平的测量值是标志转移性疾病之程度和患复发性乳腺癌患者之存活的潜在预测标记。Escott等感染与免疫(Infect.Immun.)634770-4773(1995)说明了在人白细胞和人血清中几丁质酶的活性。Overdijk等糖生物学(Glycobiology)4797-803(1994)描述了从人血清和大鼠肝中分离几丁质酶(4-甲基umbelliferyl-四-N-乙酰壳四糖苷(acetylchitotetraoside)水解酶)。Renkema等生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2702198-2202(1995年2月)从高歇氏病患者的脾中制备了人壳三糖酶。其制品有几丁质酶酶活性，该文章报道了该制品蛋白质组分的少量氨基酸序列(22个氨基末端残基和胰蛋白酶片段的21个残基)。人几丁质酶的功能还是未知的，但在该文章中未说明与高歇氏病的病理生理学的关系。同一研究小组的后一篇文献描述了克隆编码有几丁质酶酶活性之产物的人巨噬细胞cDNA。由该研究小组在其1995年2月的文章中所报道的部分氨基酸序列与人巨噬细胞cDNA产物的推测氨基酸序列相配。另外参见国际专利公开WO96/40940，其中报道了编码50kD和39kD产物的两种不同的人壳三糖酶cDNA，这两种产物都是完全有酶活性的。Renkema等欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)244279-285(1997)报道，人几丁质酶开始是作为50kD蛋白质在巨噬细胞中产生的，然后部分加工成在溶酶体中积累的39kD形式，还报道了可变剪接产生编码一种40kD几丁质酶的人几丁质酶特有mRNA.39kD和40kD这两种同种型都是C末端截短的并都有完全的几丁质酶酶活性，但很难结合几丁质。就在无免疫应答个体中，越来越多的真菌感染威胁生命的情况来看，现在本领域仍需要鉴定用于诊断和治疗真菌感染的新物质和方法。在SEQ ID NO1和SEQ ID NO3中列出了编码人几丁质酶的推测等位基因变体的两种人cDNA核苷酸序列，包括非编码5’和3’序列。人几丁质酶编码区对应于SEQ ID NO1的核苷酸2-1399或SEQ ID NO3的核苷酸27-1424，不含其信号序列的成熟分泌的人几丁质酶蛋白质的推测编码序列对应于SEQ ID NO1的核苷酸65-1399或SEQ IDNO3的核苷酸90-1424。在SEQ ID NO2和SEQ ID NO4中分别列出了由SEQ ID NOS1和3之DNA编码的多肽的氨基酸序列。21个氨基末端氨基酸(SEQ ID NOS2和4的位置-21至-1)含有一信号肽，裂解该信号肽后产生成熟的人几丁质酶蛋白质(SEQ ID NOS2和4的位置1至445)。已确定人几丁质酶的72个C末端残基对于几丁质酶酶活性是不重要的。下文实施例5说明了如何生产不含人几丁质酶72个C末端残基的N末端片段；在氨基酸373的密码子后导入终止密码子产生约39kD重组几丁质酶片段，与全长重组人几丁质酶相比，该片段有相似的特异性几丁质酶酶活性。在美国系列申请08/877599(1997年6月6日申请)中详细描述了人几丁质酶cDNA的克隆和表达，以及重组人几丁质酶的生物学活性，所述申请是美国系列申请08/663618(1996年6月14申请)的接续申请，两者均全文引入本文作为参考。本专利技术是以如下意想不到的发现为基础即人几丁质酶的基本上全部几丁质结合活性均包含在该445个氨基酸酶的99个C末端氨基酸残基内。本专利技术具体提供几丁质结合、几丁质酶失活的多肽产物。优选的几丁质酶片段产物含有人几丁质酶之54个C末端氨基酸内的几丁质-结合片段，包括由人几丁质酶的约99个C末端氨基酸组成的片段(SEQ ID NO2的约残基347至445)，由人几丁质酶的约72个C末端氨基酸组成的片段(SEQ ID NO2的约残基374至445)，由人几丁质酶的约54个C末端氨基酸组成的片段(SEQ ID NO2的约残基392至445)，由人几丁质酶的约49个C末端氨基酸组成的片段(SEQID NO2的约残基397至445)。本专利技术还提供了包括编码所述多肽片段之DNA的纯化的分离的多核苷酸；含所述DNA的载体，特别是其中所述DNA与表达控制DNA序列有效相连的表达载体；用所述DNA以可在人几丁质酶片段产物的宿主细胞中进行所述表达的方式稳定转化或转染的宿主细胞；生产人几丁质酶多肽片段产物的方法，包括在营养培养基中培养所述宿主细胞，然后从所述宿主细胞或所述营养培养基中分离所述多肽；由该方法生产的纯化的、分离的多肽；含有与异源肽或多肽融合的所述多肽的融合蛋白，异源肽或多肽包括酶例如分泌的碱性磷酸酶(SEAP)；含所述人多肽片段产物的组合物；含有与抗真菌剂结合的人几丁质酶多肽片段产物的组合物以及通过施用所述组合物，优选同时施用其他非几丁质酶抗真菌剂来治疗真菌感染的方法；含与可检测标记(包括放射性同位素、荧光团、染料、电子致密化合物和酶)结合的几丁质酶多肽片段的组合物，利用所述组合物确定样品中是否存在几丁质或确定几丁质含量的方法，所述方法包括(a)将样品与结合有可检测标记的人几丁质酶多肽片段产物接触，(b)确定与几丁质结合的标记片段产物的数量，用于诊断样品中是否存在几丁质的试剂盒；特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
几丁质－结合的，几丁质酶失活的多肽，含有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所列人几丁质酶的５４个Ｃ末端氨基酸的几丁质－结合片段。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PW格雷，LW祖克尔，
申请(专利权)人：艾科斯有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]