锚定蛋白功能的调节剂制造技术

本发明专利技术提供了用于分离神经钙蛋白并抑制神经钙蛋白活性的组合物和方法。所述组合物是含有与ＡＫＡＰ７９的神经钙蛋白结合区同源的区域的肽。还提供了确定细胞中是否含有结合神经钙蛋白和结合ＰＫＡ的锚定蛋白的方法。该方法有助于识别同时与神经钙蛋白和ＰＫＡ结合的其它蛋白。另一方面，本发明专利技术也提供了增加Ｔ细胞的白细胞介素２表达的方法。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请是共同未决美国专利申请系列No.08/503,226(1995年7月17日申请的)的接续申请，08/503,226是08/404,731(1995年3月15日申请)的接续申请，08/404,731依次又是共同未决美国专利申请No.08/344,227(1994年11月23日)的接续申请。本专利
本专利技术主要涉及调节神经钙蛋白的磷酸酶活性和调节由T细胞所进行的白细胞介素2的表达。更具体地说，本专利技术涉及用特定的肽抑制神经钙蛋白的磷酸酶活性以及通过用特定的其他肽处理细胞而提高T细胞表达白细胞介素2的能力。本专利技术背景神经钙蛋白是Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白磷酸酶，而且是许多细胞内信号途径的参与者(Guerini and Klee，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 869183-9187(1989))。已从酵母到哺乳动物的真核细胞中鉴定了所述酶。(Cyert andThorner，J.Cell.Biol.107841a(1989)and Klee et al.，Adv.Enzymol.，61149-200(19840))。由于神经钙蛋白在相同细胞中可以参与许多的信号途径，那么肯定存在一些神经钙蛋白活性特异性目标确定方式。一种特异性酶活性的目标确定细胞方式是分区化。分区化将信号途径分成不同的部分，从而促进对不同刺激的细胞应答的特异性。通过酶与特异性锚定蛋白的相互作用而产生特定酶的分区化。例如，cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)通过与A激酶锚定蛋白(AKAP)的结合而锚定在特定的细胞内位点。由于已经表明AKAP可与PKA以外的蛋白质结合，所以在本文中，通常将该蛋白质家族称为锚定蛋白。(Hirsch et al.，J.Biol.Chem.2672131-2134(1992))。cAMP通过与PKA全酶的调节亚单位(R)结合而激活PKA，然后引起活性催化亚单位(C)的释放。存在两类R亚单位分别形成I型和II型PKA全酶的RI和RII。这些PKA异构体的亚细胞分布看起来是不同的。据报道RI异构体(RIα和RIβ)明显属于胞质的，而且被排除在核区外，而高达75％的RII异构体(RIIα或RIIβ)是颗粒状的，而且与质膜、细胞骨架组分、分泌性颗粒、高尔基体、中心体，也可能与核有联系。已经在许多器官中鉴定了锚定蛋白。已经鉴定了至少七种与加州海兔，(一种海洋无脊椎动物)中的PKA调节亚单位结合的蛋白(Cheley et al.，J.Biol.Clhem.，2692911-2920(1994))。这些蛋白质之一被富集在粗膜组分和紫杉酚固定的微管中，而且可以由此将微管锚定到细胞膜上并结合PKA。已经鉴定的一种哺乳动物锚定蛋白就是与微管有关的；微管相关蛋白2(MAP2)将PKA附着到细胞骨架上(Threurkauf and Vallee，J.Biol.Chem.，2573284-3290(1982)and DeCamilli et al.，J.CellBiol.，103189-203(1986))。在MAP2上的PKA结合位点是位于该分子氨基末端区域的31个残基的肽(Rubino etal.，Neuron，，3631-638(1989)and Obar et al.，Neuron，3639-645(1989))。与微管有关的另一锚定蛋白，AKAP 150，积累在与微管紧密相关的树突中(Glantz et al.，Mol.Biol.Cell，31215-1228(1992))。AKAP 150位于数种神经元细胞中，而且是该锚定蛋白家族是锚定蛋白家族的成员哺乳动物脑中主要锚定蛋白质的。该家族的其他成员包括在牛脑中发现的AKAP 75和在人脑中发现的AKAP 79(Glantz et al.，J.Biol.Chem.，26812796-12804(1993))。AKAP 75通过两个靠近AKAP 75 N末端的不连续区而与细胞骨架元件结合。AKAP 79明显存在于人前脑突触后密质(PSDs)中(Carr et al.，J.Biol.Chem.，26716816-16823(1992))。也已被其他锚定蛋白表征了。已经表明粒层细胞暴露于滤泡刺激激素和雌二醇可以提高80kDa AKAP的表达(Carr et al.，J.Biol.Chem.，26820729-20732(1993))。已经从人甲状腺cDNA文库中克隆了另一AKAP，Ht31(Carret al.，J.Biol.Chem.，267；13376-13382(1992))。另一锚定蛋白AKAP95在细胞周期中改变其细胞内位置。AKAP95是分裂间期的完整核蛋白，但在有丝分裂期间，当核膜分裂时，AKAP95与胞质PKA有关。这表明在与细胞周期相关的cAMP应答事件中，AKAP95在以PKA特定异构体的活性为靶的过程中起作用(Coghlan et al.，J.Biol.Chem.，2697658-7665(1994))。其他已知的锚定蛋白包括将PKA与高尔基体相连的85 kDa AKAP(Rois et al.，EMBO J.，111723-1731(1992))和将PKA与中心体结合的350 kDa AKAP(Keryer et al.，Exp.Cell Res.，204230-240(1993))。已知的锚定蛋白通过一种普通的机制结合PKA。尽管锚定蛋白的一级结构不是保守的， 但是都有包括一个两亲的螺旋区的二级结构基元(Scott andMcCartney，Mol.Endo.，85-11(1994))。模拟锚定蛋白PKA结合区螺旋结构的肽可以阻断锚定蛋白与PKA调节亚单位的结合。通过氨基酸取代破坏所述肽的螺旋结构会破坏其对PKA-锚定蛋白结合的阻断作用(Carr et al.，J.Biol.Chem.，26614188-14192(1991))，这表明PKA结合发生在锚定蛋白的两亲螺旋区，而且由锚定蛋白分子二级结构控制。PKA通过锚定蛋白的细胞内结合和定位为分离象神经钙蛋白这类激酶提供了方法，所述激酶在可能以途径特异性方式起作用的许多信号途径中是共通的。PKA在许多细胞内途径中起作用。例如，在海马神经元中AKAP79和PKA之间结合的抑制已表明是抑制α-氨基-3羟基-5-甲基-4-异噁唑-丙酸/卡英酸谷氨酸盐受体。(Rosenmund et al.，Nature，368853-856(1994))。这表明PKA调节这些受体。通过可逆地磷酸化糖原磷酸化酶以应答激素诱导的细胞内cAMP的增加，PKA还可调节糖原磷酸化酶的活性(Walsh et al.，J.Biol.Chem.，2433763-3765(1969))。已表明cAMP还抑制通过MAP激酶途径传递信号(Wu et al.，Science，2621065-1072(1993))。通过激活抑制经Ras的Raf-1活化作用的PKA，可以阻断MAP激酶途径，从而介导上述抑制作用(Vojtek et al.，Cell，74205-214(1993)and Hafner et al.，Mol.CellBiol.，146696-6703(1994))。这些途径在许多细胞类型中是重要的，而且意味着许多细胞功能本文档来自技高网...

【技术保护点】
纯化并分离的多核苷酸，其编码具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３所示序列的ｐＡＣＴ５９多肽。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：RO洛卡比，VM科兰，ML霍华德，WM加拉丁，JD施科特，
申请(专利权)人：艾科斯有限公司，俄勒冈州政府，
类型：发明
国别省市：US[美国]