产紫杉醇微生物饱和突变体库的构建和高产紫杉醇菌株的选育方法技术

本发明专利技术涉及一种利用包括转座子突变方法构建产紫杉醇微生物的饱和突变体库和利用紫杉醇抗体酶联免疫筛选高产紫杉醇突变菌株的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于工业微生物和药用微生物领域，涉及一种利用包括转座子突变方法构建产紫杉醇微生物饱和突变体库和利用紫杉醇抗体酶联免疫筛选高产紫杉醇突变菌株的方法。
技术介绍
紫杉醇(taxol)是在20世纪60年代早期从太平洋紫杉中分离出来的一种二帖类生物碱，经对其化学、药理方面的研究，表明其具有广泛的抗癌活性，如对乳腺癌、子宫癌等多种癌症都具有较好的疗效。1992年美国FDA正式批准其上市，从此，紫杉醇成为抗癌新药的热点。过去这种药靠从红豆杉树中提取，但由于该树种十分稀少，生长缓慢，濒临灭绝，这种药化学结构复杂，分子量大，难以用化学合成法合成，细胞培养也未产业化，因此该药价格十分昂贵，国际市场上其针剂纯品价格高达600万美元/kg。1993年，美国科学家发现红豆杉内生真菌也能产紫杉醇。这为解决紫杉醇药源危机提供了理想的途径。1996年，加拿大Novopharm制药公司应用Alternaria alternta菌种发酵生产紫杉醇技术取得历史性进展，并达到工业化要求，使得加拿大成为世界上第一个成熟应用真菌发酵生产紫杉醇的国家。真菌发酵生产紫杉醇是最理想但也异常艰难的科研开发之路。国内华菌公司于97年粗筛到3株紫杉醇的内生真菌；后经诱变、育种终于在98年获得了高产菌Phargen AA-013，菌种表达率高达120～227mg/L。周东坡教授采用从红豆杉树中分离得到的真菌，通过发酵法产生紫杉醇，摇瓶水平可高达400μg/L，比国际最高水平高出2倍多，发酵液中紫杉醇产率达到448.52ug/L。为了产业化，除了优化产紫杉醇微生物的培养基和条件、还需要进一步提高产紫杉醇微生物的产量，利用各种育种方法可能获得紫杉醇高产菌株。突变体库就是由某种方法产生的、包含各种不同基因突变的群体。饱和突变体库是指理论上该基因组的每个基因都发生了突变的突变体库。根据公式P＝1-(1-(L/C)cf可以预测构建饱和突变体库所需的克隆数，P是发现任意一个基因插入突变的概率，L代表基因的平均长度，C是单倍体基因组的大小，n是插入突变的克隆数，f是每个克隆平均插入位点数。转座系统在当代遗传学和分子生物学研究中有很大的应用价值.它不仅能作为反向遗传学的工具，将外源基因转入受体基因组而使受体产生表型的变化，同时，其又因为能通过随机的插入突变使内源基因失活而成为正向遗传学研究中的新宠。转座子是美国遗传学家McClintock在20世纪40年代首先在玉米中发现的可从染色体的一个位置跳到另一位置，乃至从一条染色体跳到另一染色体上的特殊基因，广泛存在于几乎所有原核和真核生物中。在结构上，转座子具有共同特征，即两端是重复序列，有转座酶的识别位点，中间是结构基因，编码转座酶和另外一些蛋白质。根据转座机制，转座子分为两大类一类是DNA介导转座的转座子，以复制或直接切除两种方式获得可移动片段，重新插入基因组DNA中，有人形象地称它们的转座为剪切和粘贴模式(cut-and-pastemode)。这类转座子一般包括两种结构形式，如玉米的Ac/Ds。Ac编码转座酶，能自行转座，称为自主转座元件；Ds多是Ac的缺失体，完全或部分失去了编码转座酶的基因，不能编码转座酶，但仍保留有两侧的重复序列，能被转座酶识别，因此能在Ac编码的转座酶的作用下转座，称为非自主转座元件，类似的还有玉米的En/Spm和Mu等。另一类是RNA介导转座的逆转座子，通过转录合成mRNA，再逆转录合成新的转座元件整合到基因组中完成转座，每转座一次拷贝数增加一份，被称为复制和粘贴模式(cut-and-paste mode)。它们在基因组中拷贝数高，是构成基因组的主要成分(通常超过总DNA的一半)。转座子标签法利用转座子能整合进入昆虫或微生物基因组中，常常能破坏一个正常基因的功能，导致一种或几种突变表型标记，形成所谓转座子标签(transposon tag)。通过这种转座子标签，可跟踪杂交后代，并以转座子作探针，从基因组文库中定位基因，对基因进行突变和标记，最终达到分离和克隆基因的目的。这种方法被称为“转座子标签法”(transposon tagging)。转座子标签的设计基本原则是只保留转座子上，完成转座过程的必需片段，同时加入筛选标记与报道基因。报道基因不含有启动子，只有在转座标签插入ORF(open reading frames)，在其启动子控制下报道基因得以表达，因而用于检测直接插入基因内部的标签。筛选标记和常规质粒一样有抗性标记和营养缺陷型标记两种。通过分离转座子和突变基因的侧翼区可鉴定该基因。转座子基因标签法已用于克隆丝状真菌基因。转座子标签法已经用于克隆丝状真菌基因。常用的有2种途径1、将构建的带有转座子的载体，转化入异源寄主，从而克隆目标基因。2、利用寄主的内生同源转座子克隆基因，不必构建载体。转座子标签法已被用于果蝇分离出了十几个基因，在哺乳动物中利用反转录转座子载体也分离定位了一些基因，在植物中利用玉米Ac/Ds系统，不仅在玉米而且在异源植物中也得到了广泛应用。作为生物标签的一种，除了不需要知道基因的产物，也无须了解基因的表达特点以外，转座子的优点表现在(1)插入是完整的元件，便于分子分析(2)可从插入位点切除，产生回复突变，我们不仅可据此确认真正由转座子引起的突变，还可进一步验证突变基因的功能；(3)通过不断跳动产生新的突变，相对较少的起始转化系就可获得整个基因组的饱和突变，大大减少了工作量；(4)还可以应用于转化效率不高的微生物，通过杂交或繁殖获得新的插入突变。标记系统转座子捕捉插入突变载体如果左右边界内只包含一个选择标记基因的载体。在用这类载体建立的突变体库中，能得到部分基因功能缺失的突变体(loss-of-functionmutant)，但不能得到有功能冗余及致死效应的基因的突变体，也很难研究具有高度多效性的基因。插入突变只有产生了明显表型变化时才能被发现利用，然而在真核生物中，多数基因在被插入或破坏时，并没有明显的表型变化，其中包括功能冗余基因、多发育阶段表达基因和受环境条件诱导的基因。转座子捕捉就是为了标记和克隆这些基因设计的，在非自主转座元件上融合进一个表达受外界转录信号调节的报告基因，在适当的时候，报告基因表达，不仅能反应转座子的位置，而且它的表达模式还能反应标记基因的表达活性及调节。为了弥补这方面的不足，开发出了转座子捕捉系统如增强子捕捉(enhancer trap)、启动子捕捉(promoter trap)和基因捕捉(gene trap)三种模式。这三种载体通过插入的报告基因的表达来研究被插入基因的表达模式，而且对致死基因也可以在杂合状态下进行研究。Enhancer trap中的报告基因与一个微小的启动子相连，单独靠它无法启动报告基因的表达，或者表达效率很低。只有插入到基因组的合适位置，利用被插入基因的增强子才能使报告基因表达。所以，报告基因的表达与否，一方面反映了转座子插入的位置，另一方面反映了被插入基因的表达特性。例如，报告基因呈现时空特异性表达，则可以推断被插入的基因是时空特异性表达的。Promoter trap和enhancer trap类似，不同在于promoter trap中没有启动子部分。Gene jrap与promotertrap类本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建产紫杉醇微生物饱和突变体库的方法，其特征是利用带有颜色标记、抗性基因或营养缺陷型标记的基因的转座子体内或体外转座产紫杉醇的微生物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢建平，胡昌华，廖国建，余艳，刘雪梅，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]