建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒及其制备和检测方法技术

本发明专利技术公开了建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒及其制备方法和检测方法，试剂盒由盒体，设在盒体内的各种用液和酶标板组装成经济实用的检测试剂盒。试剂盒的制备方法简便、快捷、安全、可靠且经济实用。样品用量少，在较短的时间内就可以完成检测，且结果易于保存，应用该检测试剂盒进行双抗夹心酶联检测的方法与其他血清学检验方法相比具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，并具有较高的可重复性、经济实用等更多的优点，所以便于在基层单位推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测建兰花叶病毒的试剂盒及其制备和检测方法，特别是涉及建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒及制备该试剂盒的方法与应用该试剂盒进行建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测的检测方法。
技术介绍
建兰花叶病毒(Odntoglossum ringspot virus，ORSV)属烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，是危害兰科植物的两种主要病毒之一，分布世界各地，主要危害齿兰、建兰等。兰花一旦感染ORSV，其叶片常产生黄化条纹或不规则褪绿色斑块，病株花部甚至出现畸形或褪色斑，红色系花朵褪色斑尤为明显，对兰花的观赏价值和经济价值造成严重影响。我国兰花资源丰富，但研究表明，无论是盆栽的地生兰花还是组培的兰花，该病毒病均相当普遍.鉴于ORSV对我国兰花产业的危害性，研究其检测技术已十分重要。植物病毒检测常用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，酶免疫分析是将抗原抗体结合的特异性与酶的高效催化性相结合的技术，具有灵敏度高，特异性强等特点，但操作步骤多，耗时长，且需要相对昂贵的酶标抗体和96孔酶标板。双抗夹心酶联检测是在酶联免疫吸附测定方法基础上发展起来的检测方法，适于检测大量样品的较为灵敏、可靠和操作简便的检测技术，但目前尚未见有关双抗夹心酶联用于检测建兰花叶病毒的文献报道以及用于检测该病毒的双抗夹心酶联检测试剂盒产品。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供简便、快捷、安全、可靠且经济实用的建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测的试剂盒。本专利技术的另一目的，在于提供制备建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒的方法。本专利技术的再一目的，在于提供利用制备的建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒进行双抗夹心酶联检测建兰花叶病毒的检测方法。为实现上述目的，本专利技术的技术解决方案是 建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒，主要由盒体，设在盒体内的各种用液和酶标板组成，各种用液主要包括高效价抗血清、标记抗体、阳性样品和阴性样品，各种缓冲液和显色剂。所述的阳性样品为纯化的建兰花叶病毒。所述的阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。所述的缓冲液包括包被缓冲液20-80mmol/L pH9.6碳酸盐溶液；封闭缓冲液20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脱脂奶粉；洗涤缓冲液50-200mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；底物缓冲液5-20％ pH9.8二乙醇胺溶液；终止液1-5mol/L硫酸溶液；所述的显色剂为0.05-0.5mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。所述的建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒的制备方法，它主要包括下列步骤1、建兰花叶病毒的提取和纯化取100g曼陀罗病叶加入100ml0.5M柠檬酸缓冲液(pH6.5)匀浆后，加入100ml氯仿搅拌30分钟。在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟。取上清加入4％PEG6000和0.3mol的NaCl，搅拌后静置1小时。在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟，弃上清，用0.5M柠檬酸缓冲液(pH6.5)充分溶解沉淀后重复一次PEG沉淀。第二次取沉淀后用5mM硼酸缓冲液悬浮后，在Beckman 10,000rpm(JA-10)离心20分钟，取上清于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时。取沉淀用0.01MPB(pH7.0)重新悬浮，再进行一次差速离心，最后取沉淀用适量0.01MPB(pH7.0)溶解。若杂质太多，再进行一次差速离心。取粗提纯病毒置于10％-40％蔗糖垫梯度，于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时。收集病毒条带，再次于超速离心机使用P42A转头40,000rpm离心2小时沉淀病毒，最后溶解于0.01MPB(pH7.0)中，置于-40℃保存备用。2、抗血清的制备及纯化选用雄性白兔作免疫动物，加等量Freund氏不完全佐剂乳化的提纯病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和两次静脉注射免疫家兔。每次注射病毒的量分别是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，间隔时间为7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用琼脂双扩散法测定效价；通过辛酸沉淀法结合DEAE离子交换层析纯化抗体。用2倍体积0.1M醋酸铵调节抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合搅拌1小时，5000rpm离心30分钟，取上清，将透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5缓冲液过夜，透析除盐。取透析完全的溶液上样于离子交换柱中，用10mMTris-HCl pH8.5缓冲液5ml/min冲洗15分钟，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5缓冲液浓度梯度进行洗脱，收集洗脱峰部分，浓缩透析，获得纯化的建兰花叶病毒多克隆抗体。3抗体标记通过戊二醛二步法将碱性磷酸酶标记到纯化抗体。每1mg抗体加0.1％戊二醛0.05ml，静置1小时，置于透析袋中除去多余戊二醛。加入0.5mg碱性磷酸酶，混匀后置于4℃备用。4、阳性、阴性样品的制备阳性样品为纯化的建兰花叶病毒病毒，浓度在0.1μg-100μg/ml范围；阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。5、各种用液的制备包被缓冲液20-80mmol/L pH9.6碳酸盐溶液；封闭缓冲液20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脱脂奶粉；洗涤缓冲液50-200mmol/L pH7.4 PBS+0.05-0.3％Tween20；底物缓冲液5-20％ pH9.8二乙醇胺溶液；终止液1-5mol/L硫酸溶液；显色剂为0.05-0.5mg/ml pH9.8 PNP-Na溶液。所述的建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒的检测方法为双抗夹心酶联检测法，它包括以下步骤1)包被用碳酸盐包被缓冲液，将ORSV多克隆标记抗体抗体稀释至1～10ug/ul，在酶标板各反应孔中，每孔100ul，37℃，孵育2小时；2)封闭倾去包被液，脱脂奶粉的封闭液，每孔100ul，37℃孵育1小时，而后用洗涤缓冲液洗涤三次；3)加样加入待检测的样品，每孔100ul，并设立阴性、阳性和空白对照，37℃孵育1小时，而后用洗涤缓冲液洗涤三次；4)标记示踪加入酶标抗体，每孔100ul，37℃孵育1小时，而后用洗涤缓冲液洗涤三次；5)显色加入用5-20％pH9.8二乙醇胺底物缓冲液配制的显色液，每孔100u l，37℃孵育30分钟；6)终止反应与检测判定加入1-5mol/L硫酸的终止液，每孔50ul，在酶标仪上测定OD405值。采用上述方案后，本专利技术由盒体，设在盒体内的各种用液、酶标板组装成经济实用的检测试剂盒。试剂盒的制备方法简便、快捷、安全、可靠且经济实用。样品用量少，在较短的时间内就可以完成检测，且结果易于保存，应用该检测试剂盒进行双抗夹心酶联联检测的方法与其他血清学检验方法相比具有简单、快速、敏感、特异性强等特点，并具有较高的可重复性、经济实用等更多的优点，所以便于在基层单位推广应用。具体实施例方式本专利技术所用的主要试剂建兰花叶病毒多克隆抗体为厦门华侨亚热带植物引种园制备；PEG6000、2-巯基乙醇、Triton-100、牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；碱性磷酸酶、PNPP-Na、DEAE离子交换填充物、IgG亲合本文档来自技高网...

【技术保护点】
建兰花叶病毒双抗夹心酶联检测试剂盒，主要由盒体，设在盒体内的各种用液和酶标板组成，各种用液主要包括高效价抗血清、标记抗体、阳性样品和阴性样品，各种缓冲液和显色剂，其特征在于：　　　　所述的阳性样品为纯化的建兰花叶病毒；　　　　所述的阴性样品为封闭缓冲溶液研磨健康叶制备的溶液。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：明艳林，郑国华，童庆宣，李梅，陈良华，
申请(专利权)人：厦门华侨亚热带植物引种园，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]