一种检测磺胺喹噁啉药物残留的胶体金试纸卡制造技术

本发明专利技术提供了一种检测磺胺喹噁啉药物的胶体金免疫试纸卡，包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和背衬，其特征在于，所述反应膜上具有包被磺胺喹噁啉药物－载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠ＩｇＧ的质控区，所述结合物释放垫包被磺胺喹噁啉药物单克隆抗体－胶体金标记物。本发明专利技术还提供了一种应用上述试纸卡检测磺胺喹噁啉药物的方法，它包括步骤：首先进行样本前处理，然后用试纸卡进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的试纸卡可用于检测动物源性食品如鸡肉、鸡肝、猪肉、猪肝、尿液、蜂蜜中的磺胺喹噁啉药物残留量，其操作简单、成本低、灵敏度高、检测速度快、适合大规模推广、能够现场监控且适合大量样本筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽药残留的免疫化学速测
，借助胶体金标记 显色的免疫层析反应，快速检测磺胺喹噁啉药物残留。
技术介绍
磺胺喹噁啉(Sulfaquinoxaline)是一类预防和治疗细菌感染性疾 病的化学治疗药物。曾对畜禽疾病控制和治疗起到了重要作用。但由 于存在严重的副作用，在人体中长期存在会导致细菌对磺胺喹噁啉产 生抗药性，且有潜在的致癌性。因此我国、美国、欧盟等规定了动物 源性食品中磺胺喹噁琳药物最高残留限量(MRLS)为0.1mg/kg。目前SQX残留常用的检测方法有两种。 一种是色谱分析，如高效 液相色谱法(HPLC)，由于复杂的仪器设备和繁瑣的过程，不适合现 场监控和大量样本筛查。另一种为免疫学方法，如酶联免疫吸附法 (ELISA)。它的缺点是检测时间长，费用较高，不利于在基层单位 推广使用。而且，这两种方法都需要专业技术人员进行操作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述不足提供一种敏感度高、成本低、操 作简单、检测时间短的试纸卡。本专利技术提供了 一种用于检测SQX胶体金免疫试纸卡，包括样本 垫、包被有SQX单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫、具有包 被SQX-载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠IgG的质控区的反应 膜、吸水垫、背衬。本专利技术的磺胺噁喹啉(SQX)快速检测试纸卡釆用高度特异性的 抗体抗原反应及免疫层析分析技术，在反应膜测试区包被SQX-载体 蛋白偶联抗原、结合物释放垫包被胶体金标记的SQX单克隆抗体，利 用竟争法来检测待测样品中是否含有SQX。通过待测样品中SQX与包 被在反应膜上的SQX-载体蛋白偶联物共同竟争SQX单克隆抗体-胶 体金标记物，根据测试区红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液 中是否含有SQX或含量多少。检测时，样品滴入试剂卡孔内，当SQX在样品中浓度低于10ng/ml 时，胶体金抗体在层析过程中会被固定在反应膜上的磺胺喹噁啉偶联 物结合，在测试区(T)质控区(C)内会出现各一条红色条带。如 果SQX在样品中浓度高于10ng/ml时，胶体金抗体与SQX全部结合， 从而在(T)区内因为竟争反应不会与磺胺喹噁啉偶联物结合而不出现 红色条带。阴性样品在检测过程中由于缺少抗原抗体竟争反应，将会 在(T)区与(C)区内出现红色条带。阳性当(C)区显示出红色条带，而(T)区不显色时，判为 阳性。阴性当(C)区显示出红色条带，(T)区同时也显示出红色条 带，且(T)区颜色接近(C)线或者浅于(C)线时，判为阳性。无效当(C)区不显示出红色条带，则无论(T)区显示出红 色条带与否，该试纸卡判为无效。本专利技术还提供了制备上述试纸卡的方法，其包括步骤1) 制备包被磺胺喹噁啉药物单克隆抗体-胶体金标记物的结合物 释放垫；2) 制备具有包被磺胺喹噁啉药物_载体蛋白偶联物的测试区和包 被羊抗鼠IgG的质控区的反应膜；3) 将l)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本垫、吸水 垫和背衬组装成试纸卡。具体地说，其步骤包括(1)半抗原制备将磺胺喹恶啉与对羧基苯甲酸反应得到含一 个苯环间隔臂的磺胺喹恶啉半抗原；(2) 将磺胺喹噁啉与载体蛋白偶联，形成磺胺喹噁啉-载体蛋白偶联物；(3) 用磺胺喹噁啉-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和 小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌SQX的单克隆抗体杂交瘤 细胞株；(4) 提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体；(5) 用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；(6) 将制备的SQX单克隆抗体加入步骤5)制备的胶体金中，得 到SQX单克隆抗体-胶体金标记物；(7) 将SQX单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上， 用含0.1~1.5%卵清蛋白的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配制的缓冲液浸 湿30秒，37。C烘2h备用；(8) 将磺胺喹噁啉-人血清白蛋白偶联物(HSA)包被在反应膜 上构成测试区，并将羊抗鼠IgG包被在反应膜上构成质控区，用含O.l %牛血清的封闭液进行封闭；(9) 将样本垫0.1~1.5%的兔血清蛋白、1~1.5%吐温-20用磷酸 氢二钠和磷酸二氢钠配制的缓冲液浸泡2h, 37。C烘2h备用；(10) 磺胺喹噁啉胶体金试纸卡的组装在背衬上按顺序依次粘 附反应膜、吸水垫、结合物释放垫和样本垫，然后切成3mm宽的小条， 加塑料盒，真空包装。本专利技术的试纸卡将样本垫盖住结合物释放垫可 以延长检测结果的观察时间，样本垫也可以将检测液体充分吸收能与 金标抗体完全接触充分反应、减少误差。本专利技术的胶体金试纸卡具有敏感度高、价格低、操作简单、检测 时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长等优点。附图说明图i为本专利技术检测试纸卡的组装示意图； 图2为本专利技术的检测结果分析示意图。图中l、样本垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸收垫；5、 测试区；6、质控区；7、背衬。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施 例仅用于说明本专利技术，而不是用来限制本专利技术的范围。 实施例l SQX检测试纸卡的制备1、 SQX-载体蛋白偶联物的合成与鉴定(1) SQX-人血清蛋白(HSA)偶联物的合成 用0.1mol/L盐酸溶液配置4mol/L的SQX，滴加l %NaN02 (过量)，4"C持续搅拌。NaN02的加入量可用淀粉-碘化钾试纸或在白色瓷砖上 加l。/。淀粉和50mol/LKI进行监控。游离亚硝酸可将碘化物氧化成碘。 碘再与淀粉反应变成黑蓝色。溶液变成黑蓝色后，继续反应15min。 用pH8.6浓度为2.0mol/L的硼酸缓冲液溶解人血清蛋白质。边搅拌边加 入重氮化的半抗原(防止局部发生酸过量现象)，调节pH至9.5。冰箱 中搅拌反应2h，调节pH至9.0。用PBS透析2天，-20°。保存(浓度为 20mg/ml )。(2) 磺胺喹噁啉-卵清蛋白的合成 取碳化二亚胺100mg用pH8.0的10mol/LPBS液2.5ml充分溶解(简称l液)；取磺胺喹噁啉20mg用0.2mol/L氢氧化钠溶液2ml溶解(2液)； 取卵清蛋白25mg溶于4mll0mol/L的PB (pH8.0)液中(3液)；将(2 液)与(3液)混合，在磁力搅拌下逐渐加入(l液)(余下(X5ml )。 4°C 搅拌12h。静置10h(4。C)。用蒸馏水使之充分透析(约48h)，得免疫 原。(3) 磺胺喹噁啉-载体偶联物的鉴定将载体蛋白、SQX半抗原、SQX-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS 配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS调零，用紫外分光光度 计在波长200-800nm范围内扫描，得到载体蛋白、SQX半抗原、SQX-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明SQX与 载体蛋白偶联成功。2、 磺胺喹噁啉单克隆抗体的制备(1) 动物免疫将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为80吗/只，使其产 生多克隆抗体。(2) 细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5:l比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合， 釆用间接竟争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀 释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细 胞株。取其中一效价较高的单克隆细胞株命名为c-l-l，该细胞株已 于2007年10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测磺胺喹噁啉药物的胶体金试纸卡，包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和背衬，其特征在于，所述反应膜上具有包被磺胺喹噁啉药物－载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠ＩｇＧ的质控区，所述结合物释放垫包被磺胺喹噁啉药物单克隆抗体－胶体金标记物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建忠，何方洋，万宇平，冯才伟，赵正苗，吴小平，冯才茂，朱亮，
申请(专利权)人：北京望尔生物技术有限公司，北京望尔康泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]