定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌制造技术

本发明专利技术公开了定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌。本发明专利技术提供了一种定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株的方法，包括如下步骤:1)将初始甲基营养菌作为处理对象在含有甲醇的液体培养基中进行多次诱导培养，得到驯化后菌，所有驯化后菌组成驯化菌株库；2)发酵所述驯化菌株库中的驯化后菌，收集所有驯化后菌发酵液；3)检测所述所有驯化后菌发酵液中吡咯喹啉醌，选取发酵液中吡咯喹啉醌产量高于所述初始甲基营养菌的发酵液中吡咯喹啉醌的单菌株，为高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株。本发明专利技术通过逐步提高培养基中的甲醇浓度对甲基营养菌进行应激驯化，提高了选育正突变率以及吡咯喹啉醌产量增加幅度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌。
技术介绍
吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone，PQQ)作为细菌脱氢酶辅酶参与呼吸链电子传递，具有促进机体生长、防护肝损伤、促进神经生长因子合成、调节机体自由基水平、提高细菌对毒性和辐射等极端条件的耐受性等功能，是一种独特的生理活性物质，在食品和医药保健领域具有重要的开发前景。PQQ的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法是以无机培养基为主，成本低，产率较高且利于下游纯化，是工业化规模生产的主要方向。菌种选育是稳定菌种质量，提高发酵水平的有效手段。PQQ的生物合成机制尚未彻底阐明，基因工程改造代谢途径难度较大，诱变育种仍然是PQQ产生菌的主要选育方法。菌种选育一般分为突变库的构建和高产株筛选两个部分。PQQ突变库的构建通常采用单纯的物理、化学及其复合诱变，操作简单、速度快，但正突变率低，筛选工作量巨大。《紫外线—氯化锂诱变选育吡咯喹啉醌高产菌》(《安徽农业科学》第41卷第34期)公开了利用紫外线—氯化锂诱变肺炎克雷伯氏菌构建突变株库，并采用氧化还原法筛选高产突变株。该方法构建的突变库的正突变株的比例低，从200株的突变库中只筛选获得3株产量明显提高的突变株，筛选效率低下。目前报道的PQQ测定方法有重组酶法、薄层色谱法、活性电泳法、光谱法、氧化还原法和高效液相色谱法，重组酶法专一性强、灵敏度高，但所用的脱氢酶纯化制备繁琐不易大量获得且酶活测定过程复杂；薄层色谱法简便直观，但样品处理繁琐耗时无法定量分析；活性电泳法灵敏度高，抗干扰强，但耗时费力无法定量分析；光谱法精密度高，抗干扰性较差；氧化还原法操作简便，但使用的硝基四唑蓝极易被氧化，准确性低；高效液相色谱法准确度和灵敏度高，但工序复杂耗时，无法快速测定大量样品，效率低。高产株筛选要经过初筛和复筛两阶段，初筛的菌株量大，如果采用繁琐费时的测定方法，筛选效率低下。《3种检测吡咯喹啉醌的方法比较》(《生物技术通讯》第22卷第4期)公开了利用D326nm值与D400nm值的差值来检测PQQ含量的方法。该方法精密度高，但该方法的检测限较窄，需要对样品进行稀释，影响筛选效率。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤:1)将初始甲基营养菌作为处理对象在含有甲醇的液体培养基中进行多次诱导培养，得到驯化后菌，所有驯化后菌组成驯化菌株库；每次所述诱导培养的处理对象为上一次诱导培养后菌，且每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇浓度呈依次递增的状态；2)发酵所述驯化菌株库中的驯化后菌，收集所有驯化后菌发酵液；3)检测所述所有驯化后菌发酵液中吡咯喹啉醌，选取发酵液中吡咯喹啉醌产量高于所述初始甲基营养菌的发酵液中吡咯喹啉醌的单菌株，为高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株。上述方法中，步骤1)中，每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇体积百分含量比上次诱导培养所用培养基中的甲醇体积百分含量高0.5-1％。脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)FJNU-R8，其每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇体积百分含量比上次诱导培养所用培养基中的甲醇体积百分含量高1％，具体从2％-8％。脱氮生丝微菌FJNU-6CGMCCNO.1.12893，其每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇体积百分含量比上次诱导培养所用培养基中的甲醇体积百分含量高0.5％，具体从0.5％-8％。MethylobacteriumextorquensCGMCCNO.1.6987，其每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇体积百分含量比上次诱导培养所用培养基中的甲醇体积百分含量高0.5％，具体从1％-8％。上述方法中，所述每次诱导培养为培养至菌体OD600值比该次诱导培养前体系中菌体OD600值增加1.2-1.5；所述每次诱导培养为培养至菌体OD600值比该次诱导培养前体系中菌体OD600值具体增加1.5。上述含有甲醇的液体培养基为将甲醇与液体培养基混匀，得到培养基，所述甲醇的体积百分含量为0.5％-10％。上述方法中，所述步骤3)中，所述检测所述所有驯化后菌发酵液中吡咯喹啉醌采用酶标仪检测。上述方法中，所述酶标仪检测波长为330nm。上述酶标仪检测为测定OD330值，再通过图2所示标曲得到PQQ产量。上述方法中，在酶标仪检测步骤后，还包括用HPLC鉴定PQQ产量(图3所示标曲)的步骤。上述方法中，所述甲基营养菌为利用甲醇为唯一碳源进行生长的革兰阴性细菌。上述方法中，所述利用甲醇为唯一碳源进行生长的革兰阴性细菌为脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)或其诱变菌株，具体为脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)FJNU-R8或脱氮生丝微菌FJNU-6CGMCCNO.1.12893。上述方法中，所述利用甲醇为唯一碳源进行生长的革兰阴性细菌为扭托甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)或其诱变菌株，具体为扭托甲基杆菌MethylobacteriumextorquensCGMCCNO.1.6987。脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)FJNU-R8已于2015年3月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.10620，分类命名为脱氮生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)。本专利技术的实验证明，本专利技术通过逐步提高培养基中的甲醇浓度对甲基营养菌进行应激驯化，提高了选育正突变率以及吡咯喹啉醌产量增加幅度；同时根据吡咯喹啉醌在330nm的特征吸收峰，利用紫外分光光度法结合酶标仪批量快速测定吡咯喹啉醌样品，提高检测效率；最后通过HPLC法对少量初筛的高产菌株进行复筛，获得吡咯喹啉醌高产突变株，提高了筛选效率，缩减了育种周期。附图说明图1为PQQ标准品与发酵液上清的全波长扫描图谱。图2为PQQ浓度--330nm吸光值的标准曲线图。图3为HPLC检测的PQQ标准曲线图。图4为脱氮生丝微菌FJNU-R8突变株的PQQ含量。图5为脱氮生丝微菌CGMCCNO.1.12893突变株本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株的方法，包括如下步骤:1)将初始甲基营养菌作为处理对象在含有甲醇的液体培养基中进行多次诱导培养，得到驯化后菌，所有驯化后菌组成驯化菌株库；每次所述诱导培养的处理对象为上一次诱导培养后菌，且每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇浓度呈依次递增的状态；2)发酵所述驯化菌株库中的驯化后菌，收集所有驯化后菌发酵液；3)检测所述所有驯化后菌发酵液中吡咯喹啉醌，选取发酵液中吡咯喹啉醌产量高于所述初始甲基营养菌的发酵液中吡咯喹啉醌的单菌株，为高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株。

【技术特征摘要】
1.一种定向驯化选育高产吡咯喹啉醌的甲基营养菌突变株的方法，包括如下步
骤:
1)将初始甲基营养菌作为处理对象在含有甲醇的液体培养基中进行多次诱导培
养，得到驯化后菌，所有驯化后菌组成驯化菌株库；
每次所述诱导培养的处理对象为上一次诱导培养后菌，且每次所述诱导培养用的
培养基中的甲醇浓度呈依次递增的状态；
2)发酵所述驯化菌株库中的驯化后菌，收集所有驯化后菌发酵液；
3)检测所述所有驯化后菌发酵液中吡咯喹啉醌，选取发酵液中吡咯喹啉醌产量
高于所述初始甲基营养菌的发酵液中吡咯喹啉醌的单菌株，为高产吡咯喹啉醌的甲基
营养菌突变株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，每次所述诱导培养用的培养基中的甲醇体积百分含量比上次诱导培
养所用培养基中的甲醇体积百分含量高0.5-1％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述每次诱导培养为培养至菌体OD600值比该次诱导培养前体系中菌体OD6...

【专利技术属性】
技术研发人员：柯崇榕，黄建忠，廖灿，钟璐芳，杨欣伟，任洋，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35