磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，属于生命分析技术领域。本发明专利技术采用SiO2与不同极性的吸附剂混合组成，这些吸附剂对疏水性能不同的化合物具有不同的选择性，从而能够有效的进行分离。本方法采用的毛细管电泳法加入了修饰剂β-环糊精，首次在毛细管电泳缓冲体系中加入三氟乙酸，解决了毛细管电泳图中峰的拖尾问题，峰的对称性明显好于文献报道。本方法快速、简便，首次应用磁固相萃取技术结合毛细管电泳测定牛奶中PQQ的含量。与文献方法对比，分离效率提高了6倍。
【技术实现步骤摘要】
，属于生物分析
技术介绍
卩比咯并喹呤醌(pyrroloquinolinequinine PQQ)是一种新的氧化还原酶辅基,主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物之中，在牛奶尤其母乳中含量较高，被认为是体内必需的维生素之一。生物样本中PQQ的分析方法有气相色谱-质谱法、高效液相色谱、毛细管电泳法等 毛细管电泳是二十世纪 80 年代发展起来的一种快速分析方法，具有分析速度快、分离效率高、样品和试剂消耗量少的优点。与高效液相色谱法相比，毛细管柱容易清洗、使用寿命长。文献报道的PQQ毛细管电泳检测法是在缓冲体系加入β -丙氨酸，采用反相C18小柱固相萃取分离富集细胞培养基中的PQQ,检出限为0.1 0.2 μ M，PQQ峰型存在拖尾现象，固相萃取所用的C18小柱价格昂贵，而且步骤繁琐，工作量大。近年来，磁纳米固相萃取技术在生物样品制备领域受到广泛关注。由于磁性萃取介质直接分散于样品溶液中，接触面大，对生物样品和液体中含固体悬浮物的样品尤其适合，样品处理简单。本专利技术采用SiO2与不同极性的吸附剂混合组成，这些吸附剂对疏水性能不同的化合物具有不同的选择性，从而能够有效的进行分离。本方法快速、简便，首次应用磁固相萃取技术结合毛细管电泳测定牛奶中PQQ的含量。本方法采用的毛细管电泳法加入了修饰剂环糊精，首次在毛细管电泳缓冲体系中加入三氟乙酸，解决了毛细管电泳图中峰的拖尾问题。峰的对称性明显好于文献报道。与文献方法对比，分离效率提高了 6倍。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，使PQQ与其他较难分离的电中性杂质达到高效快速的分离。本专利技术的技术方案:一种:( I)毛细管选择及预处理:选用未涂层的41.5cmX50ym石英毛细管柱； 新毛细管柱先依次用甲醇冲洗IOmin,蒸懼水冲洗5min, lmol/L NaOH溶液冲洗30min,蒸懼水冲洗5min,最后再用运行缓冲液冲洗10-15min ;每次进样前，用蒸馏水及运行缓冲液冲洗2min ；运行缓冲液及样品溶液均用0.22 μ m微孔针头过滤器过滤；(2)毛细管电泳分析条件:检测波长为249nm，进样方式为0.5psi压力进样，进样时间10.0秒，分离电压为25kv，毛细管柱温25°C ；运打缓冲液为:pH=8.8、10mmol/L砸砂_10mmol/L β _环糊精_质量浓度0.1% 二氟乙酸的混合液。(3)生物样本中吡咯并喹呤醌PQQ的检测选用牛奶作为生物样本的典型，①Fe3O4磁性纳米粒子的制备:IOOmLl.25mM FeSO4.7Η2060 下搅拌，用 6Μ NaOH 调 pH 至 10，Ih 后磁性沉淀物分离，用去离子水冲洗，60°C真空干燥6h，得Fe3O4磁性纳米粒子；②改性的混合磁性功能纳米粒子Fe304-Si02-Phenyl_C8的制备:将制备得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入到含ImM四甲氧基硅烷、ImM苯基三甲氧基硅烷和ImM辛基三甲氧基硅烷混合液中，四甲氧基硅烷:苯基三甲氧基硅烷:辛基三甲氧基硅烷体积比1:1:1，加50mL含w/v0.01%吐温-100、w/v0.02%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的v/vl2.5%甲醇和0.3mL w/v25%NH3作催化剂，120°C搅拌回流12 16h，用水、丙酮、正己烷依次清洗多次，60°C真空干燥6h，得磁性功能纳米粒子Fe304-Si02-Phenyl-C8 ； ③牛奶样品去除蛋白ImL牛奶加5mL甲醇，润旋振荡2min,4000rpm离心IOmin,上清液用50mLMcIlvaine buffer缓冲液稀释，以备磁性固相萃取；McIlvaine buffer缓冲液为:ρΗ7.0,0.1M柠檬酸调0.2Μ磷酸氢二钠溶液；④磁性固相萃取称取上述制备好的50mg磁性功能纳米粒子Fe304-Si02-Phenyl_C8于安普瓶中，分别用ImL的甲醇和水活化；加入步骤③处理后的牛奶样品溶液10mL，涡旋萃取lmin，甲醇解吸3min，解吸液经氮气吹干，用pH7.0、100 μ L磷酸缓冲液稀释，进行毛细管电泳分析。本专利技术的有益效果:本专利技术采用SiO2与不同极性的吸附剂混合组成，这些吸附剂对疏水性能不同的化合物具有不同的选择性，从而能够有效的进行分离。本方法快速、简便，首次应用磁固相萃取技术结合毛细管电泳测定牛奶中PQQ的含量。本方法采用的毛细管电泳法加入了修饰剂环糊精，首次在毛细管电泳缓冲体系中加入三氟乙酸，解决了毛细管电泳图中峰的拖尾问题。峰的对称性明显好于文献报道。与文献方法对比，分离效率提高了 6倍。附图说明图1pH对PQQ保留时间的影响。图2PQQ毛细管电泳图，运行缓冲液10mmol/L硼砂-10mmol/LP -环糊精，pH=8.8,分尚电压25kV。图3PQQ毛细管电泳图，运行缓冲液10mmol/L硼砂-10mmol/LP -环糊精，pH=8.8,0.1 % 二氣乙酸,分尚电压25kV。图4PQQ标准曲线。图5a:牛奶磁固相萃取后的毛细管电泳图，b:含20μ g/mL PQQ标准品的牛奶溶液经磁固相萃取后的毛细管电泳图。具体实施例方式实施例1( I)毛细管电泳分析条件:未涂层石英毛细管柱(41.5cmX50 μ m，河北永年县锐沣色谱器件有限公司)，新毛细管先用甲醇冲洗lOmin，蒸馏水冲洗5min，lmol/L NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min,最后再用运行缓冲液冲洗10_15min。运行缓冲液及样品溶液均用0.22 μ m微孔针头过滤器过滤。每次进样前，用蒸馏水和运行缓冲液冲洗2min。检测波长是249nm，进样方式为压力进样(0.5 ^，10.0秒)，分离电压为251^，毛细管柱温25°C。运行缓冲液为:10mmol/L硼砂-lOmmol/L β -环糊精混合液，ρΗ=8.8，含有质量浓度0.1%的三氟乙酸。( 2)缓冲体系的选择缓冲体系及浓度直接影响离子的迁移和分离。实验考察了 PQQ在甘氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼砂缓冲体系中的分离情况。结果峰型很差，都达不到理想的分离状况。可能PQQ分子中具有多羧基的缘故，具有较低的淌度，其淌度方向和电渗流方向相反，影响它的流出，不能得到较好的峰型。因此，本实验考虑在背景电解液中加入环糊精，β-环糊精上的14个仲羟基位于空腔的宽口，其疏水性空腔可以选择性地和分析物形成包合物。PQQ上的羧基与β_环糊精上的羟基能够形成稳定的包合物，从而影响样品的权均淌度，因此改善了分离。我们在不同缓冲体系(甘氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼砂缓冲液)中加入β环糊精，结果显示，硼砂环糊精缓冲体系较好，与单纯的硼砂相比，峰型有了很大的改善，能得到较尖锐的峰。( 3 )硼砂浓度的选择缓冲液浓度是一个重要的指标，对选择性的影响非常突出。我们分别用硼砂浓度5,10,15, 20mmol/L实验，当浓度大于10mmol/L时,峰形严重不对称,分离效果不佳。可能随着浓度的增加，导电的离子数增加，毛细管的电流值增大，焦耳热增加；而且随着缓冲液浓度的增加，离子强度增加，电渗流速降低，溶质在毛细管内的迁移速度下降，迁移时间会延长。当浓度小于10mmol/L时,前沿拖尾较为严重。因此,我们选择硼砂浓度为10mmol/L时最为合适。(4) pH值对本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种磁性固相萃取?毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，其特征在于：（1）毛细管选择及预处理：选用未涂层的41.5cm×50μm石英毛细管柱；新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，1mol/L?NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10?15min；每次进样前，用蒸馏水及运行缓冲液冲洗2min；运行缓冲液及样品溶液均用0.22μm微孔针头过滤器过滤；（2）毛细管电泳分析条件：检测波长为249nm，进样方式为0.5psi压力进样，进样时间10.0秒，分离电压为25kV，毛细管柱温25℃；运行缓冲液为：pH=8.8、10mmol/L硼砂?10mmol/Lβ?环糊精?质量浓度0.1%三氟乙酸的混合液；（3）生物样本中吡咯并喹呤醌PQQ的检测选用牛奶作为生物样本的典型①Fe3O4磁性纳米粒子的制备100mL1.25mM?FeSO4·7H2O60℃下搅拌，用6M?NaOH调pH至10，1h后磁性沉淀物分离，用去离子水冲洗，60℃真空干燥6h，得Fe3O4磁性纳米粒子；②改性的混合磁性功能纳米粒子Fe3O4?SiO2?Phenyl?C8的制备将制备得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入到含1mM四甲氧基硅烷、1mM苯基三甲氧基硅烷和1mM辛基三甲氧基硅烷混合液中，四甲氧基硅烷:苯基三甲氧基硅烷:辛基三甲氧基硅烷体积比1:1:1，加50mL含w/v0.01%吐温?100、w/v0.02%十六烷基三甲基溴化铵的v/v12.5%甲醇和0.3mL?w/v25%NH3作催化剂，120℃搅拌回流12～16h，用水、丙酮、正己烷依次清洗多次，60℃真空干燥6h，得磁性功能纳米粒子Fe3O4?SiO2?Phenyl?C8；③牛奶样品去除蛋白1mL牛奶加5mL甲醇，涡旋振荡2min，4000rpm离心10min，上清液用50mL?McIlvaine?buffer缓冲液稀释，以备磁性固相萃取；McIlvaine?buffer缓冲液为：pH7.0、0.1M柠檬酸调0.2M磷酸氢二钠溶液；④磁性固相萃取称取上述制备好的50mg磁性功能纳米粒子Fe3O4?SiO2?Phenyl?C8于安普瓶中，分别用1mL的甲醇及水活化；加入步骤③处理后的牛奶样品溶液10mL， 涡旋萃取1min，甲醇解吸3min，解吸液经氮气吹干，用pH7.0、100μL磷酸缓冲液稀释，进行毛细管电泳分析。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周杏琴，毛师师，张建康，曹国宪，钦晓峰，
申请(专利权)人：江苏省原子医学研究所，
类型：发明
国别省市：
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