鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法技术

本发明专利技术涉及一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，以经分离并培养得到的链球菌为分析样品，依次进行以下各步骤：胶块制备、细胞裂解、洗胶块、胶块内DNA的酶切、加样、电泳、图像获取；所述的胶块制备、细胞裂解、洗胶块、加样和图像获取步骤都按照常规脉冲场凝胶电泳方法进行，并对各参数进行优化；所述的洗胶块的水浴温度为50℃；所述的胶块内DNA的酶切酶为SmaI酶；所述的电泳参数中，电压为6V/cm，对应的脉冲时间为10~45秒，电场夹角为120°，电泳温度为14℃，总电泳时间为22小时。本发明专利技术对鱼源链球菌区分能力更强，整个实验流程耗时缩短了3~4天，这对于鱼源链球菌病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种脉冲场凝胶电泳分型方法，尤其是一种。
技术介绍
链球菌是在自然界中广泛存在的一种条件致病菌，2009年以来，由无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Streptococcus inia)引起的链球菌病严重制约了我国罗非鱼产业的发展，并呈现发病区域逐年扩大、发病率和死亡率逐年升高，易感罗非鱼规格范围逐年扩大等新趋势。传染性疾病的爆发，需要对致病微生物进行分型，分型方法包括基于表型特征分析的表型方法和基于基因型特征的基因型方法。目前流行的基因型分型方法包括质粒分型、限制性内切酶分析(REA)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型和基于PCR(聚合酶链反应,polymerase chain react ion )技术的随机扩增多态性DNA标记(RAPD )、扩增片段长度多态性(AFLP)、细菌基因组重复序列PCR技术(I^p PCR)和多位点序列分型(MLST)等。质粒分型的缺点是检测对象是质粒，而不是遗传稳定性更高的染色体；REA技术的缺点是大量小片段DNA用传统琼脂糖电泳难以区分和比较；PCR技术的优点是快速便捷，缺点是检测的都只是染本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鱼源链球菌脉冲场凝胶电泳快速分型方法，采用从鱼源上分离并培养得到的链球菌作为分析样品，其特征是，包括以下工艺步骤：（1）胶块制备：（1?1）、将链球菌样品在血平板培养基上培养18～24小时后，用无菌接种环刮取单菌落重悬于2ml的TE缓冲液中，得到细菌悬浊液，调整细菌悬浊液的OD值为3.6～4.5；（1?2）、取160～185μL细菌悬浊液于1.5ml离心管中，加入5～10μL浓度为10mg/ml的溶菌酶，混合均匀；将细菌悬浊液与溶菌酶的混合溶液置于37℃水浴中孵育15～30分钟；从水浴中取出离心管，加入5～10μL浓度为20mg/ml的蛋白酶K和5～20μL浓度为1mg/ml的变溶菌素；（...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨弘，祝璟琳，邹芝英，单航宇，韩珏，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：