离子束辅助脉冲电泳的玉米转基因技术制造技术

本发明专利技术公开了一种离子束辅助脉冲电泳的玉米转基因技术，对成熟的玉米种子进行Ｎ离子注射后，将其置于特制的琼脂糖凝胶胶块中进行脉冲电泳，然后培养成苗的一种玉米转基因技术。采用本方法可以对批量的玉米种子进行转基因，种子损伤小、成苗率高，大大的提高了转化效率。本方法可以在常温、常压的常规实验室进行，不受季节限制，避免传统的玉米转基因过程中受生长季节限制的缺陷，为玉米的遗传育种提供了一种新的转基因方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是生物
的一种玉米转基因方法，尤其涉及一种以玉米成熟种子为 材料，进行离子束辅助脉冲电泳的玉米转基因方法。
技术介绍
玉米是是我国和世界主要的农作物之一，玉米的生产对于世界和我国的粮食问题 具有重要的意义。随着世界人口的增长和环境的恶化，育种工作者遇到了前所未有的挑战， 而常规育种又有着育种进程慢、遗传资源匮乏等缺点。因此，开展玉米转基因育种技术研究 势在必行。目前，玉米转基因技术中已发展了多种转化方法，而以农杆菌介导法和基因枪法 最为成熟。尽管如此，这两种方法仍有很大的缺陷，例如农杆菌介导法对玉米基因型要求 严格，不同基因型之间转化效率表现差异较大，再生时间长以及玉米幼胚作为该方法的最 为常用外植体受到季节生长的限制，严重影响转化效率；基因枪法又有着转化频率低、工作 量大和耗材昂贵等缺点。因此，研究者一直致力于开发一种具有转化频率较高、不受生长季 节和基因型限制等特点的转基因方法。脉冲电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)是 Schwartz 等人于 1984 年专利技术的一种全新的电泳技术，用于分离约IOMbp的DNA片段。其原理是在凝胶上外加正交 电场，交替变化的电场能够使DNA分子重新定向在狭小的凝胶中不断向前运动而分离。利 用脉冲电泳技术分离大片段的DNA分子原理为带壁的植物细胞进行外源基因导入目的受 体提供了一种新思路。自从杨金水等人利用低压脉冲电泳对水稻愈伤组织进行转化获得成 功后，在随后几年内，脉冲电泳作为一种新型的转基因方法逐渐受到研究者的重视并得到 了很大的发展。目前，利用该技术虽有多个物种相继报道获得了成功，但该方法的缺点是转 化频率低，转化频率不稳定。造成这一缺点的原因主要有以下几个方面1.根据目前报道的研究，使用该技术必须对植物细胞进行处理，例如水稻种子 要诱导出愈伤组织，然后酶解细胞壁，释放出没有细胞壁的原生质体，才能实现转化的成 功。而这种处理效率低，对外植体伤害大。2.不同的物种间形成胚性愈伤组织的能力差异较大，表现最为明显的是玉米等单 子叶植物胚性愈伤组织的诱导较为困难，因此会导致下一步的成苗率差、转化效率低等缺点。3.使用的外源DNA本身没有穿透细胞膜的能力，主要依靠脉冲电流在处理材料的 细胞膜上形成穿孔，外源DNA才能进入植物细胞，最终整合到基因组。选择合适的电泳时间 及电压是外源DNA成功转移的首要条件，电泳时间过长对外植体影响较大，影响成苗率，电 泳时间过短不能使外源DNA最大量的进入细胞内，降低转化效率；同样，电压小不足以使细 胞膜形成穿孔，电压过大易使材料失去活性。正是由于以上的各种原因，大大降低了脉冲电泳转基因的效率和不稳定性，严重 制约着该技术的发展与应用，无法获得长足发展。
技术实现思路
本专利技术提供一种基于提高脉冲电泳转化效率和稳定性为目的，以离子束辅助脉冲 电泳转化玉米种子并直接成苗的转基因方法。该方法以成熟的玉米种子为材料，对种子进 行N离子进行注射处理后，进行脉冲电泳转基因，并获得转基因玉米，该方法为玉米的遗传 转化提供了一种新方法，为玉米的转基因育种奠定了基础。本方法主要通过以下技术方案实现一种离子束辅助脉冲电泳的玉米转基因技 术，对成熟的玉米种子进行N离子注射后，将其置于特制的琼脂糖凝胶胶块中进行脉冲电 泳，然后培养成苗的一种玉米转基因技术。具体包括如下步骤(1)选取成熟饱满的玉米种子，在0. I^WHgCl2中进行消毒15min，然后用无菌水 冲洗3-5次，剥去种胚周围种皮；将消毒并剥皮的种子分单层、均勻排布在培养皿内，种胚 朝向束流方向，进行N离子注射处理；(2)将处理后的种子置于包埋胶中，制作支持胶，然后将包埋玉米种子的包埋胶放 入支持胶上，放入电泳槽，将要转化的外源基因样品注入支持胶起始位置的样孔内，开始电 泳；(3)电泳结束后，将玉米种子放入MS培养基上成苗，然后移到大田，待3-4叶期进 行除草剂抗性筛选和PCR检测。通过对后代植株进行除草剂抗性筛选及PCR检测，表明外 源基因已经成功的导入受体，获得了玉米转基因植株。作为本专利技术的优选技术方案，进行N离子注射处理时，剂量为2X 1016N7cm2。作为本专利技术的另一优选方案，电泳时间为120min。与已有技术相比，本专利技术的优点体现在1.本方法在进行脉冲电泳前，将玉米种子进行一定剂量的N离子注射处理，研究 认为，离子束对植物的细胞壁具有溅射作用，最终在细胞壁上可以产生穿孔和损伤，为后续 脉冲电泳过程中外源DNA进入细胞提供了通道，与单独使用脉冲电泳转基因相比，该方法 大大提高了玉米的转基因效率。2.本方法避免了在脉冲电泳前对细胞进行酶解细胞壁的流程，可以直接对批量的 玉米种胚进行转基因，提高了工作效率，避免了玉米胚性愈伤组织诱导困难的缺陷，大大降 低了工作量，提高了成苗率，有利于转化效率的提高。3. 一定剂量的离子束处理后，注入离子的正电荷降低了细胞表面的负电荷，在进 行脉冲电泳过程中，减弱了对外源DNA的排斥力，促进了外源DNA进入细胞，提高了细胞对 进入的外源DNA的吸附力，对转化效率的提高起到了重要作用。4.外源DNA进入细胞后，必须整合到受体基因组中，转化才有可能成功。离子束对 种子进行注射处理后，能够对细胞核和染色体块结构产生一定破坏，在一定程度上打断细 胞内的染色体DNA结构，对于外源DNA进入细胞内并整合到受体基因组是有利的，促进转化 效率的提高。附图说明图1为本专利技术中不同N离子剂量对玉米发芽的影响。图2为本专利技术中脉冲电泳时间对出苗率的影响。 具体实施例方式1.玉米种子的N离子注射处理1. 1选取玉米A188自交系成熟种子，使用0. 1 %的HgCl2中进行消毒15min，然后 用灭无菌水冲洗3-5遍，剥去种胚周围的种皮；1. 2将消毒好的玉米种子排列于直径IOcm的培养皿中，种胚朝着束流方向，剂量 分别为 2X IO16NVcm2,5X IO16NVcm2,8X IO16NVcm2 和 11 X IO16NVcm2,同时以一份不经离子 束处理的种子作为对照。通过对Ml代种子发芽率、出苗率和存活率进行统计，表明选用 2X IO16NVcm2剂量的离子束对玉米种子处理后，Ml代种子表现出发芽和出苗的刺激效应， 在此之后，随着辐照剂量的增加，三种诱变源均表现出对Ml代种子发芽和出苗的抑制效 应，呈显著的负相关，如图1。2.离子束辅助的脉冲电泳使用北京科斯佳科技公司提供的k5061866型号的脉冲电泳仪，以2 X IO16NVcm2剂 量的N离子注射处理后的玉米A188玉米自交系种子为材料，进行离子束辅助的脉冲电泳转基因。2. 1脉冲电泳时间的优化受离子束照射影响，加上脉冲电场对种子损伤，对种子出苗及成活率影响较大，因 此，选择合适的电泳时间尤为重要。本专利技术中设计了不同电泳时间，以研究对成苗率的影 响，分别为0，90，120，150和180min，然后将其置于MS培养基上，统计成苗率(3次重复)； 另外，待幼苗移入大田到四叶期，对抗性苗进行PCR检测，统计转化效率。研究结果表明电 泳时间为120min时，既能保证良好的出苗率又能使一定外源DNA进入种子内部，保证了较 高的转化效率，如图2。2. 2本方法研究结果表明本文档来自技高网...

【技术保护点】
离子束辅助脉冲电泳的玉米转基因技术，其特征在于：对成熟的玉米种子进行Ｎ离子注射后，将其置于特制的琼脂糖凝胶胶块中进行脉冲电泳，然后培养成苗的一种玉米转基因技术。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：程备久，朱苏文，赵阳，江海洋，彭晓剑，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：34[]