自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法及其专用免疫亲和吸附剂技术

本发明专利技术公开了一种自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法及其专用免疫亲和吸附剂。该用于自动物样品中提取磺胺喹噁啉的免疫亲和吸附剂，是由固相载体和与其偶联的磺胺喹噁啉单克隆抗体组成；所述磺胺喹噁啉单克隆抗体是磺胺喹噁啉半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的。本发明专利技术的提纯方法结合色谱法高效检测磺胺喹噁啉药物的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法及其专用免疫亲和吸附剂。
技术介绍
随着生命科学的发展，人们对生物体内的物质及其变化产生了越来越浓厚的兴 趣，而生物样本的分析就成为探索和发现生命奥秘的必要手段。由于生物样本成分 复杂，待测物浓度较低，而且大多数取样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。免疫亲和色谱(IAC, immunoaffinity chromatography)是一种 将免疫反应与色谱分析方法相结合的分析方法。它的高度选择性和高亲和性无疑使 分析过程简化。在兽药残留分析中，IAC最简单而且最有效的应用方式是作为理化 测定技术(如HPLC,GC)的样品净化手段，这种联用方法可使免疫学技术和理化技 术在选择性、分离能力、速度和灵敏度方面得到互补，并避免了免疫分析法(如 ELISA， RIA)直接测定样品的诸多不足。目前，该方法在抗体、激素、多肽、酶、 重组蛋白、受体病毒及小分子化合物的分析中被广泛应用。磺胺喹噁啉(Sulfaquinoxaline,SQX)属磺胺类抗生素(见图1)，兼有抗球虫作 用，广泛用于养禽业，其口服后吸收迅速，但排泄缓慢，残留在组织器官及鸡蛋中 时间长，人食用后，对人体产生耐药性等副作用。世界卫生组织(WHO)规定动物组 织、奶的最高残留限量(MRL)值为100pg/kg。日本等国规定肉鸡中不得检出。因此， 为保证产品的安全及对外贸易畅通，加强对动物性食品中磺胺喹噁啉的残留检测是 非常必要的。检测磺胺喹噁啉残留量的化学方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法 (GC)、高压液相色谱法(HPLC)、气—质联机(GC-MS)、液—质联机(HPLC/MS)、 毛细管电泳(CE)等。这些方法的前处理利用液一液分配，常规的SPE柱净化和分 离，都在不同程度地存在着处理过程繁琐、净化效果差、有机溶剂浪费多、所需时 间长等缺点。免疫亲和技术是90年代在分析领域得到应用的新技术，但用免疫亲和 柱净化基质中的磺胺喹噁啉药物未见报道，更无商品化的IAC柱出售。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法及其专用免疫亲和吸附剂。本专利技术所提供的用于自动物样品中提取磺胺喹噁啉的免疫亲和吸附剂，是由固 相载体和与其偶联的磺胺喹噁啉单克隆抗体组成；所述磺胺喹噁啉单克隆抗体是磺 胺喹噁啉半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的。所述磺胺喹噁啉半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将磺胺喹噁啉半抗原和载体 蛋白用混合酸酐法进行偶联得到；所述磺胺喹噁啉半抗原是将磺胺喹噁啉和琥珀酸 酐通过縮合反应得到的。所述载体蛋白可为牛血清白蛋白或卵清蛋白等常用载体蛋白。磺胺喹噁啉是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产 生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。本专利技术将磺胺喹噁啉 半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原。磺胺喹噁啉半抗原与卵清蛋白(OVA)、牛血 清蛋白(BSA)的结合摩尔比分别为33:1和25: 1。所述固相载体可为纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖 凝胶或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶，优选为Sepharose,B。-所述磺胺喹噁啉单克隆抗体优选为对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4 CGMCC No. 2571分泌的单克隆抗体。所述对磺胺喹噁啉的单克隆杂交瘤细胞株C-2-4已于2008年6月30日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北 京市朝阳区大屯路)，保藏登记号为CGMCC No. 2571。所述免疫亲和吸附剂可装载入柱中制成免疫亲和色谱柱，该免疫亲和色谱柱也 属于本专利技术的保护范围。含有上述免疫亲和吸附剂或免疫亲和色谱柱的试剂盒也属于本专利技术的保护范围。所述试剂盒中还包括洗脱液，所述洗脱液可由甲醇、纯水和冰乙酸组成，所述 甲醇、纯水和冰乙酸的体积比为90:9.8:0.2。所述试剂盒中还包括洗涤液和保存液； 所述洗涤液可为0.01 M， pH7.4的磷酸盐缓冲液，g卩lL中含有0.2gKH2PO4， 0.2 g KC1， 2.9gNa2HP04.12H20， 8.8 g NaCl的水溶液；所述保存液为在上述洗涤液中添 加NaN3至其终浓度为0.02 g/L得到的溶液。该免疫亲和吸附剂以及含有该免疫亲和吸附剂的色谱柱基于免疫反应和色谱反 应，适合从生物样品(如肌肉、肝、肺、肾、血浆等)中提取净化磺胺喹噁啉，便 于残留分析。在该免疫亲和吸附剂中，单克隆抗体与溴化氰活化的S印harose4B的偶联率是 92.5°/0±1%，动态柱容量为2803ng/mL士12ng/mL，使用了 15次后柱容量为总柱容量的45%左右，保存期为1年。本专利技术所提供的自动物样品中提取磺胺喹噁啉的方法，包括以下步骤1) 样品的前处理取动物组织样品匀浆物，加入提取液进行提取，然后进行离心力是2000 g -3000g 的离心，取上清液作为样品溶液；所述提取液由甲醇和水组成，所述提取液中甲醇 和水的体积比为8: 2; 所述离心力优选为2400 g;2) 将步骤l)得到的样品溶液与所述洗涤液混合，过上述任一种免疫亲和色谱 柱，然后依次用权利要求所述洗涤液、水、所述洗脱液进行洗脱，收集得到磺胺喹 噁啉溶液。本专利技术的免疫亲和吸附剂及色谱柱具有高选择性，使样品前处理过程大大简化， 尤其适用于生物样品中微量磺胺喹噁啉的前处理。免疫亲和吸附剂及色谱柱的高选 择性使得磺胺喹噁啉分析方法的检测限将主要取决于取样量，这是单纯理化手段难 以达到的；本专利技术的免疫亲和色谱柱对待测组分有很强的保留和浓縮能力，只要加 样量不超过柱容量，在实测样品条件下免疫亲和吸附剂对组分的保留能力几乎不受 样品体积或组分浓度的影响。本专利技术的方法对组分净化的同时还可提供定性信息。 本专利技术的方法水相操作，操作简单，净化效果好，免疫亲和色谱柱能重复使用，能 节省大量的有机溶剂，降低分析成本和环境污染。本专利技术的净化方法结合色谱法可 高效检测磺胺喹噁啉的含量，弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、 定量准确差，或理化方法选择性低等不足，体现了免疫学技术和常规理化技术在分 析机制的互补性。 附图说明图1为磺胺喹噁啉的结构式图2为磺胺喹噁啉半抗原合成技术路线图图3为空白鸡肌肉组织、添加鸡肌肉组织和磺胺喹噁啉标准品色谱图 图4为空白猪肌肉组织、添加猪肌肉组织和磺胺喹噁啉标准品色谱图 具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的实 验材料，如无特别说明，均从商业途径得到。实施例l、净化磺胺喹噁啉药物的免疫色谱柱的制备 1、磺胺喹噁啉鼠单克隆抗体的制备 (l).免疫原的合成a.半抗原的合成如图2所示，将磺胺喹噁啉(美国Sigma公司，商品目录号967-80-6)和琥 珀酸酐通过縮合反应得到具有羧基官能团的半抗原，具体的方法如下称取lOOmg 磺胺喹噁啉和25mg琥珀酸酐放入圆底烧瓶，向其中加无水吡啶至完全溶解，8(TC加 热搅拌反应10h;反应结束后，减压蒸馏去溶剂，残余物用丙酮洗涤5次，用乙酸 乙酯-正己垸使其结晶，得到磺胺喹噁啉半抗原。b.免疫原合成将磺胺喹噁啉半抗原与卵清蛋白采用混合酸酐法进行偶联得到免疫原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于自动物样品中提取磺胺喹噁啉的免疫亲和吸附剂，是由固相载体和与其偶联的磺胺喹噁啉单克隆抗体组成；所述磺胺喹噁啉单克隆抗体是以磺胺喹噁啉半抗原与载体蛋白的偶联物为免疫原得到的抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建忠，张素霞，史为民，李炳玉，万宇平，曹兴元，江海洋，冯才伟，李建成，王战辉，李存，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]