一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒制造技术

一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，其中包括：三聚氰胺特异性抗体、三聚氰胺－载体蛋白偶联物和酶标二抗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶联免疫和兽药残留检测领域。具体而言，本专利技术涉及一种用于检测三聚氰 胺的酶联免疫试剂盒。
技术介绍
三聚氰胺(Mdamine)，简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是 一种重要的氮杂环有机化工原料，白色结晶粉末，无味。这种化学品常被用于生产塑料、胶水 和阻燃剂，在部分亚洲国家，它也被用以制造化肥。它是一种禁止用于宠物食品及动物饲料的 化学物质，动物食用后可以使动物发生肾衰竭并导致死亡。然而，2007年3月中旬以来，美国发生多起宠物猫、狗中毒死亡事件。经调查，是由于 一些宠物伺料供应商为了增加饲料中蛋白质的含量，在小麦蛋白粉和大米蛋白粉中添加了三 聚氰胺，从而导致猫、狗中毒死亡。因此亟需建立方便快捷且敏感度高的检测方法，禁止此类事件的发生。 现有的三聚氰胺检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样品的净化、浓縮等步 骤的影响较大；再者这些方法需要复杂的仪器，且过程繁琐，不适应现场大量样本的筛査。 基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。 该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。因为三聚氰胺是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得 到具有免疫原性的人工抗原。三聚氰B妾的ELISA方法尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒。本专利技术提供了一种快速检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括三聚氰胺特异 性抗体、三聚氰胺-载体蛋白偶联物和酶标二抗。其中三聚氰胺特异性抗体为兔抗三聚氰胺的 多克隆抗体，可用三聚氰胺与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔)制得。所 述的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)。所述的三 聚氰胺-载体蛋白偶联物采用化学方法偶联得到。所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶， 所述酶标二抗可以用商品化的辣根过氧化物酶酶标二抗，也可以通过过碘酸钠法或戊二醛法 将辣根过氧化物酶与二抗偶联制得。在本专利技术的一个优选实施方案中，所述酶标二抗为羊抗 兔IgG抗体。用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。 载体的形式是微量反应板凹孔。为方便现场检测和大量样本筛査，所述试剂盒还可以进一步包括三聚氰胺抗原或抗三聚 氰胺特异性抗体的酶标板、三聚氰胺标准溶液、显色剂、洗涤液、终止液和浓縮样品稀释液。所述的洗涤液为0.05%_0.5%吐温一20磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显 色剂B液组成(例如，体积比为l:l)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液为 邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述的浓縮样品稀释液为含0.1%吐温一20的磷酸盐缓冲液。另一方面，本专利技术还提供了一种检饲料测样品中三聚氰胺含量的方法，包括步骤(1) 样品前处理；(2) 用权利要求l一9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有三聚氰胺抗原的酶标板孔中 加入标准品或样品溶液，再加入抗三聚氰胺多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗， 孵育后洗涤拍干，显色、终上，用酶标仪测定吸光度值；(3) 分析检测结果。 本专利技术试剂盒的检测原理为将三聚氰胺抗原吸附于固相载体上，加入样本或三聚氰胺标准品溶液并加入三聚氰胺抗体 工作液，待测样品中三聚氰胺和固相载体上包被的三聚氰胺抗原竞争三聚氰胺抗体，再加入 酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中三 聚氰胺的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出三聚氰胺浓度范围。 有益效果本专利技术检测三聚氰胺的试剂盒主要采用间接竞争酶联免疫测定法定性或定量样品中三聚 氰胺含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。本专利技术该试剂盒采用高特异性的三聚氰胺多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可 以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本专利技术具 有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动 化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在饲料及动物源性产品检测中发挥重要作用。 附图说明图1为三聚氰胺酶联免疫检测试剂盒结构示意图。其中1为试剂盒盒体，2为包被了三聚 氰胺抗原或抗三聚氰胺特异性抗体的酶标板，3为系列标准溶液，4为显色剂A， 5为显色剂 B， 6为抗体溶液，7为酶标二抗溶液，8为酶标二抗稀释液，9为浓縮洗涤液，10为浓縮样 品稀释液，ll为试剂瓶架。图2为三聚氰胺抑制曲线。提供下述实施例是为了更好地进一步理解本专利技术，而决不对本专利技术的内容和保护范围构 成任何限制。实施例l免疫原的合成及免疫血清的制备1.1试剂与仪器三聚氰胺(北京百灵威试剂有限公司)，琥珀酸酐(购自北京耀北生物技术有限公司)， 吡啶(Pyridine, AR. WM=79.10，含量〉99.5%，天津市科密欧化学试剂开发中心)，N, N_ 二甲基甲酰胺(Dimethylformamide， DMF，美国新泽西州ACROSORGANICS公司生产，购 自百灵威化学试剂公司)，正三丁胺(Tributylamine，美国新泽西州ACROSORGANICS公司 生产，购自百灵威化学试剂公司)，氯甲酸异丁酯购(自百灵威化学试剂公司)，牛血清白蛋 白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等(购自北京耀北生物技术有限公司)，其它试剂均为分析纯。 双光束紫外可见分光光度仪(TU-1909,北京普析通用仪器有限公司)，层析装置(3057 型便携式记录仪，重庆川仪四厂；SBS系列数控计滴器，恒流泵，自动部分收集器，层析柱， 上海沪西分析仪器厂)，磁力搅拌器(上海东荣丰科学仪器有限公司)，台式离心机(Minispin 最大转速13400 rpm最大离心力12100 rcf， 2mlxl2)， 1. 2三聚氰胺人工抗原的合成称取三聚氰胺63.06 mg (0.5mmoD溶于5 ml吡啶溶液中，加入琥珀酸酐50 mg室温搅 拌反应过夜。吹干吡啶，用10ml溶剂(DMF和1，4~二恶烷1 : 1混合)溶解Rac-戊二酸酐半醛，加入 131iU(约0.5mmol)三丁胺，冰中搅拌10min，加入氯甲酸异丁酯72 iU (约0.5mmo1)，转 入室温搅拌反应l小时。活化的三聚氰胺溶液逐滴加入到0.1MpH 8.5冰冷载体蛋白(BSA 或OVA)硼酸钠溶液中，l小时内加完，室温搅拌反应过夜。然后，将偶联物过SephadexG—25M凝胶层析纯化，用0.01M pH 7.4 PBS三倍柱床体积 平衡，调节流速至3ml/min，样品浓縮至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联物，洗 脱液用pH7.4 0.01M PBS。 免疫及特异性抗体的制备将上述三聚氰胺-BSA偶联物用生理盐水稀释成lmg/ml溶液备用。选取6只体重2 2.5Kg健康雄性新西兰大白兔。将偶联物与等量弗氏完全佐剂通过注射 器对抽法混合成油包水的乳浊液，按lmg/Kg体重的量进行首次免疫，采取背部皮下多点注 射。每隔两周加强免疫一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及方法同首次免疫。 从第三次免疫开始，每次免疫后10天，耳缘静脉取血lml，进行抗体效价检测，当本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，其中包括：三聚氰胺特异性抗体、三聚氰胺－载体蛋白偶联物和酶标二抗。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨曙明，于洪侠，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：11