【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸检测，具体而言，涉及一种核酸分子的免扩增检测方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、dna在生物体内以双螺旋形式稳定存在，其互补链与探针争夺与目标单链结合的机会，因此如何有效地获取目标dna的单链并使其与互补探针高效结合是一项具有挑战性的任务。
2、目前，已经报道了多种关于非扩增的dna杂交检测方法，现有技术大多采用高温变性和低温复性的方式来实现靶标单链与探针的杂交。然而，这种方法的杂交效率并不高，因为部分模板链不可避免地会与互补单链发生杂交，导致信号干扰和低效的检测。
3、鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种核酸分子的免扩增检测方法、试剂盒及其应用以提高杂交效率和检测效率。受到dna扩增原理的启发，本专利技术创新性地开发了一种新的方法，旨在提高dna杂交效率和检测效率。
2、本专利技术是这样实现的：
3、第一方面，本专利技术提供了一种核酸分子的免扩增检测方法，检测方法不以疾病的诊断为目的，其包括如下步骤：将第一探针、第二探针、dna聚合酶与待测核酸分子混合反应，反应体系不含dntp，其中，第一探针和第二探针中的至少一个探针带有可被检测的标记物，检测反应产物中标记物的水平；第一探针和第二探针能分别与待测核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成dna杂交链。
4、本专利技术的创新性地引入了新的dna杂交方法，命名为“lamp-like hybridization(
5、本专利技术使用探针为引物，在dna聚合酶的作用下，完成了模板双链的解旋和引物与模板链的结合，且在反应体系中不添加dntp，此时引物的延伸过程将受到阻碍，从而实现了探针与目标单链的高效结合。高效结合后的dna杂交链可以借助现有的检测设备对带有可被检测的标记物的探针进行检测，通过反应产物中标记物的水平，从而判定是否含有目的基因。
6、本专利技术中，待测核酸分子可以是来自环境样本、生物样本的任何dna序列。包括不限于：土壤、海洋、石油、农药污染土、植物、动物、微生物等样本。
7、本专利技术提供的方法无需扩增，仅仅通过dna聚合酶反应，使得第一探针和第二探针结合到单链dna上获得dna杂交链，然后通过后续的检测即可实现定性或定量检测。
8、在本专利技术应用较佳的实施方式中，dna聚合酶为taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4 dna聚合酶或klenow片段。
9、在一种可选的实施方式中，dna聚合酶选自等温扩增酶。
10、在本专利技术应用较佳的实施方式中，dna聚合酶为具有解螺旋功能和促进探针与模板链结合功能的dna聚合酶。
11、在一种可选的实施方式中，等温扩增酶选自bst dna聚合酶。
12、在一种可选的实施方式中，由于phi29 dna聚合酶只具有dna聚合功能，不具备解旋功能，须在杂交反应体系中另外添加重组酶和单链dna结合蛋白来实现核酸的变性(rpa反应原理)。
13、在本专利技术应用较佳的实施方式中，可被检测的标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种。
14、在一种可选的实施方式中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)羟基光素(fam)、四氯光素(tet)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(rbitc)、四甲基罗丹明(tamra)、罗丹明b(tritc)等或其类似物)、cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy3等或其类似物)、alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(pe)、藻蓝蛋白(pc)、别藻蓝蛋白(apc)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(precp)等)。
15、在可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
16、在可选的实施方式中，放射性同位素包括但不限于212bi、131i、111in、90y、186re、211at、125i、188re、153sm、213bi、32p、94mtc、99mtc、203pb、67ga、68ga、43sc、47sc、110min、97ru、62cu、64cu、67cu、68cu、86y、88y、121sn、161tb、166ho、105rh、177lu、172lu和18f。
17、在一种可选的实施方式中，化学发光试剂选自吖啶酯、鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素、联吡啶钌、二氧环乙烷、洛粉碱、异鲁米诺和过氧草酸盐中的至少一种。
18、胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
19、在可选的实施方式中，胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
20、在一种可选的实施方式中，第一探针和第二探针二者中的任意一个为报告探针，另一个为捕获探针。报告探针用于报告目标基因的含量，捕获探针用于将核酸分子与固相结合，从而方便后续针对固相表面结合的核酸分子进行分离、检测。
21、当所述dna聚合酶为bstdna聚合酶时，第一探针、第二探针、dna聚合酶与待测核酸分子混合反应条件为62-65℃反应20-30min，95℃反应5-10min。在其他实施方式中，dna聚合酶的浓度和反应温度可以根据特定的检测要求进行调整。
22、如phi29 dna聚合酶的最适温度为37-42℃，taq酶最适温度为55-65℃，并需预先设置95℃反应5min从而使得dna双链变性。
23、第二方面，本专利技术提供了一种免扩增的dna杂交检测的试剂盒，其包括：第一探针、第二探针、dna聚合酶、无dntp的反应缓冲液和固相，其中，第一探针和第二探针中的至少一个探针带有可被检测的标记物；第一探针和第二探针能分别与待测核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成dna杂交链；固相选自试纸条、纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、试管、ep管、多孔板微量反应板凹孔、nc膜、pdms膜或芯片；固相上具有能与dna杂交链上的标记物结合的偶联物或物理连接物，或能与dna杂交链上的探针序列互补的核苷酸序列。
24、无dntp的反应缓冲液例如选自dnt本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸分子的免扩增检测方法，其特征在于，所述检测方法不以疾病的诊断为目的，其包括如下步骤：将第一探针、第二探针、DNA聚合酶与待测核酸分子混合反应，反应体系不含dNTP，其中，所述第一探针和第二探针中的至少一个探针带有可被检测的标记物，检测反应产物中标记物的水平；所述第一探针和第二探针能分别与待测核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成DNA杂交链。
2.根据权利要求1所述的核酸分子的免扩增检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶或Klenow片段；
3.根据权利要求1所述的核酸分子的免扩增检测方法，其特征在于，所述可被检测的标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种；
4.一种免扩增的DNA杂交检测的试剂盒，其特征在于，其包括：第一探针、第二探针、DNA聚合酶、无dNTP的反应缓冲液和固相，
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一探针和第二探针二者中的任意一个为报告探针，另一个为捕获探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，当所述固相为试纸条时，所述捕获探针上带有第二标记物，所述报告探针上带有第一标记物和/或具有化学修饰物；且所述试纸条包括依次设置的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维膜上设置有质控线和检测线，所述质控线上包被有能与所述第一标记物结合的偶联物和/或与所述捕获探针互补的质控序列；所述检测线上包被有能与所述第二标记物结合的偶联物或物理连接物；
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，当所述固相为磁珠时，所述磁珠表面修饰有与所述标记物结合的偶联物或物理连接物；
8.一种核酸免扩增检测系统，其特征在于，其包括：
9.根据权利要求8所述的核酸免扩增检测系统，其特征在于，所述检测装置为光学检测设备、荧光读数仪、化学发光免疫分析仪、放射性免疫分析仪或时间分辨荧光免疫分析仪。
10.如权利要求4-7任一项所述的试剂盒以及权利要求8-9任一项所述的核酸免扩增检测系统在病原微生物检出、外源基因检测中的应用，所述应用不以疾病的诊断为目的。
...【技术特征摘要】
1.一种核酸分子的免扩增检测方法，其特征在于，所述检测方法不以疾病的诊断为目的，其包括如下步骤：将第一探针、第二探针、dna聚合酶与待测核酸分子混合反应，反应体系不含dntp，其中，所述第一探针和第二探针中的至少一个探针带有可被检测的标记物，检测反应产物中标记物的水平；所述第一探针和第二探针能分别与待测核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成dna杂交链。
2.根据权利要求1所述的核酸分子的免扩增检测方法，其特征在于，所述dna聚合酶为taq、bst、vent、phi29、pfu、tru、tth、tl1、tac、tne、tma、tih、tf1、pwo、kod、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4 dna聚合酶或klenow片段；
3.根据权利要求1所述的核酸分子的免扩增检测方法，其特征在于，所述可被检测的标记物选自生物素、荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和胶体中的至少一种；
4.一种免扩增的dna杂交检测的试剂盒，其特征在于，其包括：第一探针、第二探针、dna聚合酶、无dntp的反应缓冲液和固相，其中，所述第一探针和第二探针中的至少一个探针带有可被检测的标记物；所述第一探针和第二探针能分别与待测核酸分子的同一模板链的不同区域进行特异性结合形成dna杂交链；所述固相选自试纸条、纳米颗粒、磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球、乳胶微球、试管、ep管...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈爱亮，王楠，张娟，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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