【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种通过基因甲基化信号预放大提高检测肿瘤灵敏率的方法。
技术介绍
1、肺癌从最初病变发展成癌浸润转移需要5-10年时间，早期发现不仅治疗效果好，其医疗开支也低。但一旦突破这个阶段，随着病程变长，病变速度加快，治疗费用高，效果很差。因此，早期诊断和治疗是应对肺癌的最佳方法。由于肺癌早期没有特异性的临床表现，虽然有许多肿瘤早期信号出现，但是缺乏高敏感性和特异性的早期诊断技术，大多数患者确诊时已经是癌症晚期，如常见的磨玻璃为主的肺结节，它们的良恶性判断最主要就是基于胸部ct影像的表现，但是很难给予鉴别，最终诊断往往是在中晚期。
2、肿瘤的早期诊断通常取决于两个关键因素：检查指标的高灵敏度和无创、简便的检测方法。随着科技的快速发展，肿瘤标志物已经发展成为肿瘤诊断和治疗的新领域、新的挑战和希望。肿瘤标志物可在体液或组织中检测，可反映肿瘤的存在、分化程度、预后估计和治疗效果。
3、人体血液循环系统中不断流动着血液细胞，体细胞和血液细胞破裂降解后，释放胞浆中的内含物，包括蛋白质、外泌体、rna及携带有各种遗传信息的dna片段即cfdna(cellfree dna)。该类dna片段含有例如突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等异常情况，特别是来自肿瘤基因组的ctdna(circulating tumordna，循环肿瘤细胞dna)片段。ctdna由于获取过程侵犯性低、可多次获得、还可以观察动态变化等被作为液体活检的重要的检测样品。
4、随着基因诊断技术的不断发展，国内
5、作为一种新的分子标记，dna甲基化在肿瘤诊断中受到越来越多的关注，其优点是：第一，在肿瘤形成过程中，启动子高甲基化频繁发生，甚至高于基因突变，其中有许多与肿瘤形成相关癌基因和抑癌基因的甲基化；其次，甲基化是肿瘤发生早期的重要事件；第三，dna甲基化是稳定存在的，可以通过pcr扩增效应检测；第四，存在一定的组织特异性。因此，甲基化检测在肿瘤早期诊断中具有潜在的应用价值。
6、通常肿瘤基因的异常甲基化dna只占外周血总dna的极小部分(cfdna)，约为0.1％～1％。这些未甲基化的dna与甲基化的dna只是略有不同，因此有必要从高度复杂的“背景”中检测出异常的甲基化dna。此外，循环血液中的dna通常是降解的(通常是几十到几百个碱基对)，ctdna在血浆中的半衰期只有2.5小时，因此，需要及时提取和优良的提取技术才能获得高回收率。目前一般应用磁珠法进行dna的提取纯化实验，其使dna可吸附到羟基修饰的高分子磁珠表面(即固相载体)，形成了“核酸-磁珠复合物”，同时磁珠具有超顺磁性，可以通过外磁场进行吸附操作，该过程是可逆的，在适当条件下，dna分子可以被洗脱回收。
7、由于癌症的发生是多因素、多基因、多步骤的，临床上虽然也同样诊断为肺癌，但是其病因可能是不同的，可以是吸烟引起，或是家族遗传因素，职业工种及生活方式等。因此这些患者的癌变机制完全不同病因。所以，需要提供一种多基因检测试剂盒，可以涵盖癌变机制的多个信号转导系统，包括各种吸烟、遗传和环境职业等致癌因子，因此需要可同时检测多个因素引起肺癌的相关基因的甲基化状态。为此，需要对配对肿瘤样品如肺癌(癌组织和癌旁正常组织)dna进行全基因甲基化测序(ngs)和rna的表达测定。从几万个候选基因中，通过不同方法逐步验证，缩小到近十个甲基化基因。并且用另外一组病人肺癌组织dna进行验证，获得自主研发肺癌早期相关的基因甲基化标志物，目前已有一些甲基化靶基因用于肺癌的早期检测，涵盖了更多的致癌变的因素，提高了方法检测率和特异性。
8、目前检测基因甲基化的方法大致分为特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化图谱分析。特异位点的甲基化检测方法主要包括甲基化特异性pcr(ms-pcr)、亚硫酸氢盐处理+测序、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(cobra)、荧光定量法(methylight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析和焦磷酸测序；而甲基化图谱分析包括基因芯片、高通量测序ngs、飞行质谱。
9、用血浆或尿液粪便等来源的cfdna进行多基因甲基化检测时，经常遇到的实际问题是获得的血浆cfdna量过低，递送的肿瘤信号太弱而无法检测，导致这些问题的主要原因在于：1、早期肿瘤小，细胞凋亡时进入血液cfdna很少；2、小片段cfdna在核酸提取时被丢失及被体细胞dna污染，使有效信号比例下降；3、为了检测基因的甲基化，首先需要区分样品dna中基因甲基化cpg位点和非甲基化cpg位点，因此首先需要用亚硫酸氢盐修饰技术将样品dna中非甲基化cpg位点进行化学转化，然后用能识别基因甲基化cpg位点的引物进行特异性扩增；但是进行化学转化时不能避免dna降解，造成信号丢失降低；即使收集8ml病人全血，获得4ml血浆中的cfdna也仅为50ng，而来自肿瘤的dna(ctdna)只约0.5ng，有时会更低。因此，需要用基因甲基化信号前置放大技术帮助，以提高检测的灵敏度。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是精确的对肺部结节进行诊断和鉴别，从而达到对肺癌早期诊断。
2、本专利技术首先保护一种肺癌诊断和鉴别试剂盒，可包括用于扩增shox2基因的外侧引物对、用于扩增pitx2基因的外侧引物对、用于扩增grik2基因的外侧引物对、用于扩增hoxa9基因的外侧引物对、用于扩增ptger4基因的外侧引物对、用于检测shox2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测pitx2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测grik2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测hoxa9基因甲基化水平的引物探针组和用于检测ptger4基因甲基化水平的引物探针组。
3、shox2基因的geneid为6474。
4、pitx2基因的geneid为5308。
5、grik2基因的geneid为2898。
6、hoxa9基因的geneid为3205。
7、ptger4基因的geneid为5734。
8、所述肺癌诊断和鉴别试剂盒具体可由用于扩增shox2基因的外侧引物对、用于扩增pitx2基因的外侧引物对、用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种肺癌鉴别诊断试剂盒，包括用于扩增SHOX2基因的外侧引物对、用于扩增PITX2基因的外侧引物对、用于扩增GRIK2基因的外侧引物对、用于扩增HOXA9基因的外侧引物对、用于扩增PTGER4基因的外侧引物对、用于检测SHOX2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测PITX2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测GRIK2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测HOXA9基因甲基化水平的引物探针组和用于检测PTGER4基因甲基化水平的引物探针组；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增内参基因的外侧引物对。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述用于扩增内参基因的外侧引物对为ACTB引物组-1；
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组为引物探针组ACTB-1或引物探针组ACTB-2；
<...【技术特征摘要】
1.一种肺癌鉴别诊断试剂盒，包括用于扩增shox2基因的外侧引物对、用于扩增pitx2基因的外侧引物对、用于扩增grik2基因的外侧引物对、用于扩增hoxa9基因的外侧引物对、用于扩增ptger4基因的外侧引物对、用于检测shox2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测pitx2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测grik2基因甲基化水平的引物探针组、用于检测hoxa9基因甲基化水平的引物探针组和用于检测ptger4基因甲基化水平的引物探针组；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增内参基因的外侧引物对。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述用于扩增内参基因的外侧引物对为actb引物组-1；
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于检测内参基因甲基化水平的引物探针组。
6.根据权利要...
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