【技术实现步骤摘要】
本专利技术具体涉及检测饲料及原料中常见致病菌相关扩增引物、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、饲料是畜牧业发展的命脉，饲料质量安全与畜产品质量安全息息相关。作为畜禽的主要食物来源，饲料质量不仅直接决定畜禽肉质好坏，还间接影响环境以及人类的健康。饲料含有丰富的碳水化合物、脂肪、蛋白质及维生素等营养物质，在加工、运输及储藏过程中极易被微生物感染，例如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌、大肠埃希氏菌等。微生物大量繁殖不仅会导致饲料营养成分遭到破坏，还会产生具有强毒性的毒素。被污染的饲料用于饲养动物除了会造成动物中毒发病，给养殖者带来巨大的经济损失；在患病动物治疗过程可能存在抗生素滥用或过量使用的现象，从而引起细菌耐药，存在潜在的耐药菌传播风险；还会在动物体内富集通过畜产品进入人体，危害人体健康。因此，应大力控制微生物对饲料的污染，加强对饲料微生物的检测，对我国畜牧业健康发展有重要意义。
2、目前针对饲料中致病菌的检测以微生物培养和鉴定法为主。传统培养方法检测致病菌，增菌及选择分离方法各不相同，需要用到大量培养基和生化试剂，且操作较复杂，检测周期长(约5-7days)，当选择分离效果不好时，容易因为没挑到菌而漏检，这无疑增加了企业对于饲料储藏成本及质量控制的成本，也加大了政府对于饲料安全的监管难度。目前与饲料中微生物检测相关的标准仍局限于沙门氏菌、大肠菌群、霉菌总数、蜡样枯草芽孢杆菌等少数几种菌的检测，对其他常见微生物则只能参照食品中的致病菌的检测，一般按照有关标准方法主要依赖于传统的分离鉴定，针对于每种致病菌均需要其特定的
3、实时荧光定量pcr技术准确度和灵敏度高，与传统的基于微生物培养的检测方法相比更加省时省力。但受其荧光通道的限制，目前单管荧光pcr最多能检测3个靶标左右，针对大于3个致病菌的检测，只能分两管甚至更多管进行，工作量大，不利于同时针对多个(＞6)靶标的同时筛检。而且荧光定量pcr对操作者的操作熟练程度及结果分析要求较高。
4、基因膜芯片法利用“反向斑点杂交技术(rdb)”，将待测靶标基因中的特异性序列作为探针固定在尼龙膜上，同时利用多对带生物素标记的引物对待测靶标基因进行扩增，通过酶-底物显色，产生肉眼可辨的信号。具有快速、准确、高通量、平行化等优点，解决了荧光定量pcr技术检测通量低的问题，单次反应可同时筛检数十种指标。但多重pcr在的引物除了考虑引物特异性外，还要考虑不同引物之间的相互作用、错配以及竞争等情况，检测目标量越大，引物设计难度就越大。
5、因此，利用膜芯片技术检测平台开发一种快速、简便、高通量的检测常见致病菌相关扩增引物、试剂盒及其应用是目前待决解的技术问题。
技术实现思路
1、专利技术要解决的技术问题是提供一种鉴定或辅助鉴定沙门氏菌、大肠埃希氏菌o157:h7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌及产气荚膜梭菌的多重pcr引物，进一步提供了与扩增产物特异性结合的探针，上述引物和探针配合用于对上述致病菌的反向斑点杂交检测。
2、为了解决上述问题，本专利技术提供了鉴定或辅助鉴定常见致病菌的多重pcr引物组合物。
3、所述引物组合物包括引物对a、引物对b、引物对c、引物对d、引物对e、引物对f、引物对g、引物对h和引物对k这9对引物中的9对、8对、7对、6对、5对、4对、3对、2对或1对；
4、所述引物对a由a-f和a-r组成，所述a-f是核苷酸序列为seq id no.1的单链dna分子，a-r是核苷酸序列为seq id no.2的单链dna分子；
5、所述引物对b由b-f和b-r组成，所述b-f是核苷酸序列为seq id no.4的单链dna分子，b-r是核苷酸序列为seq id no.5的单链dna分子；
6、所述引物对c由c-f和c-r组成，所述c-f是核苷酸序列为seq id no.7的单链dna分子，c-r是核苷酸序列为seq id no.8的单链dna分子；
7、所述引物对d由d-f和d-r组成，所述d-f是核苷酸序列为seq id no.10的单链dna分子，d-r是核苷酸序列为seq id no.11的单链dna分子；
8、所述引物对e由e-f和e-r组成，所述e-f是核苷酸序列为seq id no.13的单链dna分子，e-r是核苷酸序列为seq id no.14的单链dna分子；
9、所述引物对f由f-f和f-r组成，所述f-f是核苷酸序列为seq id no.16的单链dna分子，f-r是核苷酸序列为seq id no.17的单链dna分子；
10、所述引物对g由g-f和g-r组成，所述g-f是核苷酸序列为seq id no.19的单链dna分子，g-r是核苷酸序列为seq id no.20的单链dna分子；
11、所述引物对h由h-f和h-r组成，所述h-f是核苷酸序列为seq id no.22的单链dna分子，h-r是核苷酸序列为seq id no.23的单链dna分子；
12、所述引物对k由k-f和k-r组成，所述k-f是核苷酸序列为seq id no.31的单链dna分子，k-r是核苷酸序列为seq id no.32的单链dna分子；
13、所述常见致病菌为沙门氏菌、大肠埃希氏菌o157:h7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌和产气荚膜梭菌这9种致病菌的9种、8种、7种、6种、5种、4种、3种、2种或1种。
14、所述为大肠埃希氏菌o157:h7。
15、上文中，所述至少一种包括至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少九种。
16、上文中，所述对引物对a、引物对b、引物对c、引物对d、引物对e、引物对f、引物对g、引物对h和引物对k中至少有一条引物具有标记物。可为a-r、b-r、c-r、d-r、e-r、f-f、g-r、h-f、k-r引物具有标记物。所述标记物可为生物素。可为a-r、b-r、c-r、d-r、e-r、f-f、g-r、h-f、k-r引物的5′端具有生物素修饰。
17、上述引物组合物中，所述a-f、a-r、b-f、b-r、c-f、c-r、d-f、d-r、e-f、e-r、f-f、f-r、g-f、g-r、h-f、h-r、k-f和k-r的物质的量比为170：255：500：750：170：255：350：525：100：150：300：200：200：300：450：300：200：300。
18、上述的引物组合物中，还包括引物对i和引物对j中的至少一种；
19、所述引物对i由i-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.鉴定或辅助鉴定常见致病菌的多重PCR引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括引物对A、引物对B、引物对C、引物对D、引物对E、引物对F、引物对G、引物对H和引物对K这9对引物中的9对、8对、7对、6对、5对、4对、3对、2对或1对；
2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述A-F、A-R、B-F、B-R、C-F、C-R、D-F、D-R、E-F、E-R、F-F、F-R、G-F、G-R、H-F、H-R、K-F和K-R的物质的量比为170：255：500：750：170：255：350：525：100：150：300：200：200：300：450：300：200：300。
3.如权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，还包括引物对I和引物对J中的至少一种；
4.如权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，所述A-F、A-R、B-F、B-R、C-F、C-R、D-F、D-R、E-F、E-R、F-F、F-R、G-F、G-R、H-F、H-R、I-F、I-R、J-F、J-R、K-F和K-R的物质量比为170：255：500：750：170：
5.鉴定或辅助鉴定鉴定或辅助鉴定常见致病菌的产品，其特征在于，所述产品包括下述任一种：
6.权利要求1-4任一所述的引物组合物或权利要求5所述的产品在下述任一中的应用；
7.如权利要求1-4任一所述的引物组合物、权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的引物组合物或生物材料，其特征在于，所述常见致病菌为沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌、蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲杆菌或产气荚膜梭菌中的一种或多种。
8.一种检测鉴定或辅助鉴定常见致病菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一所述的引物组合物，还包括探针A、探针B、探针C、探针D、探针E、探针F、探针G、探针H、探针I、探针J和探针K中的至少一种；
9.权利要求8所述的试剂盒在下述任一中的应用；
10.鉴定或辅助鉴定常见致病菌的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要去1-4任一所述引物组合物对待测样本进行体外核酸扩增，根据体外核酸扩增的特异性产物判断待测样本中是否存在见致病菌；
...【技术特征摘要】
1.鉴定或辅助鉴定常见致病菌的多重pcr引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括引物对a、引物对b、引物对c、引物对d、引物对e、引物对f、引物对g、引物对h和引物对k这9对引物中的9对、8对、7对、6对、5对、4对、3对、2对或1对；
2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述a-f、a-r、b-f、b-r、c-f、c-r、d-f、d-r、e-f、e-r、f-f、f-r、g-f、g-r、h-f、h-r、k-f和k-r的物质的量比为170：255：500：750：170：255：350：525：100：150：300：200：200：300：450：300：200：300。
3.如权利要求1或2所述的引物组合物，其特征在于，还包括引物对i和引物对j中的至少一种；
4.如权利要求3所述的引物组合物，其特征在于，所述a-f、a-r、b-f、b-r、c-f、c-r、d-f、d-r、e-f、e-r、f-f、f-r、g-f、g-r、h-f、h-r、i-f、i-r、j-f、j-r、k-f和k-r的物质量比为170：255：500：750：170：255：350：525：100：150：300：200：200：3...
【专利技术属性】
技术研发人员：张维，王培龙，魏书林，朱怀恩，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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