一种检测三聚氰胺的直接竞争法酶联免疫试剂盒，其中包括：三聚氰胺特异性抗体、三聚氰胺标准品和酶标记三聚氰胺。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶联免疫和兽药残留检测领域。具体而言，本专利技术涉及一种用于检测三聚氰 胺的直接竞争法酶联免疫试剂盒。
技术介绍
三聚氰胺(Melamine)，简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是 一种重要的氮杂环有机化工原料，白色结晶粉末，无味。这种化学品常被用于生产塑料、胶水 和阻燃剂，在部分亚洲国家，它也被用以制造化肥。它是一种禁止用于宠物食品及动物饲料的 化学物质，动物食用后可以使动物发生肾衰竭并导致死亡。2007年3月中旬以来，美国发生多起宠物猫、狗中毒死亡事件。经调査，是由于一些宠 物饲料供应商为了增加饲料中蛋白质的含量，在小麦蛋白粉和大米蛋白粉中添加了三聚氰胺， 从而导致猫、狗中毒死亡。因此亟需建立方便快捷且灵敏度高的检测方法，禁止此类事件的发生。 现有的三聚氰胺检测方法多为色谱法，但是这些方法需要有完善的实验室，有经验的技 术人员，复杂的仪器设备，且检测过程繁琐，不适应现场大量样本的筛査。基于抗原抗体免 疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。基于此原理建立 的直接竞争法酶联免疫检测技术较间接方法进一步縮短了检测时间。该技术的关键是完全抗 原和酶标记抗原的合成及抗体的制备。目前，三聚氰胺的直接竞争酶联免疫检测方法尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒。本专利技术提供了一种快速检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括三聚氰胺特异 性抗体酶标板、酶标三聚氰胺。其中三聚氰胺特异性抗体为兔抗三聚氰胺的多克隆抗体，用 三聚氰胺与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔)制得。所述的酶标记三聚氰 胺采用化学方法偶联得到，标记酶为辣根过氧化物酶，所述偶联方法为琥珀酸酐法。用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。 载体的形式是微量反应板凹孔。为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括包被有三聚氰胺特异性 抗体的酶标板、三聚氰胺标准溶液、显色剂、洗涤液、终止液、酶标物稀释液和浓縮样品稀 释液。所述的洗涤液为0.05%—0.5%吐温一20磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为1:1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液 为邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述的浓縮样品稀释液为含0.1%吐温一20的磷酸盐缓冲液， 所述的酶标物稀释液为含0.01%吐温一20的磷酸盐缓冲液。另一方面，本专利技术还提供了一种检测饲料样品中三聚氰胺含量的方法，包括步骤(1) 样品前处理；(2) 用权利要求l一9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有三聚氰胺抗体的酶标板孔中 加入标准品或样品溶液，再加入酶标记三聚氰胺，孵育后洗涤拍干，加入显色剂显色、终止， 用酶标仪测定吸光度值；(3) 分析检测结果。 本专利技术试剂盒的检测原理为将三聚氰胺抗体包被于固相载体上，加入样本或三聚氰胺标准品溶液并加入酶标记三聚氰 胺工作液，待测样品中的三聚氰胺与酶标记三聚氰胺竞争固相化的三聚氰胺抗体，通过洗涤 出去未结合的酶标记物，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中三聚氰胺的量呈 负相关，与标准曲线比较即可得出三聚氰胺浓度范围。 有益效果本专利技术检测三聚氰胺的试剂盒主要采用直接竞争酶联免疫测定法定性或定量检测样品中 三聚氰胺含量；进一步縮短了检测时间，有间接竞争法的2个小时縮短为1个小时，对样品 的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。本专利技术该试剂盒采用高特异性的三聚氰胺多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可 以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本专利技术具 有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动 化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在词料及动物源性产品检测中发挥重要作用。 附图说明图1为三聚氰胺抑制曲线。提供下述实施例是为了更好地进一步理解本专利技术，而决不对本专利技术的内容和保护范围构 成任何限制。实施例l三聚氰胺免疫原的合成及免疫血清的制备1.1试剂与仪器三聚氰胺(北京百灵威试剂有限公司)，琥珀酸酐(购自北京耀北生物技术有限公司)， 吡啶(Pyridine, AR. WM=79.10，含量>99.5%，天津市科密欧化学试剂开发中心)，N， N-二甲基甲酰胺(Dimethylformamide， DMF，美国新泽西州ACROSORGANICS公司生产，购 自百灵威化学试剂公司)，正三丁胺(Tributylamine，美国新泽西州ACROSORGANICS公司 生产，购自百灵威化学试剂公司)，氯甲酸异丁酯购(自百灵威化学试剂公司)，牛血清白蛋 白(BSA)、辣根过氧化物酶(HRP)等(购自北京耀北生物技术有限公司)，其它试剂均为分析 纯。双光束紫外可见分光光度仪(TU-1909，北京普析通用仪器有限公司)，层析装置(3057 型便携式记录仪，重庆川仪四厂；SBS系列数控计滴器，恒流泵，自动部分收集器，层析柱， 上海沪西分析仪器厂)，磁力搅拌器(上海东荣丰科学仪器有限公司)，台式离心机(Minispin 最大转速13400 rpm最大离心力12100 rcf， 2mlxl2)。 1. 2三聚氰胺人工抗原的合成称取三聚氰胺63.06 mg(0.5mmo1)溶于5 ml吡啶溶液中，加入琥珀酸酐50 mg室温搅 拌反应过夜。吹干吡啶，用10ml溶剂(DMF和1,4~二恶垸1 : 1混合)溶解Rac-戊二酸酐半醛，加入 131ul(约0.5mmol)三丁胺，冰中搅拌10min，加入氯甲酸异丁酯72 ul (约0.5mmo1)，转 入室温搅拌反应1小时。活化的三聚氰胺溶液逐滴加入到0.1M pH 8.5冰冷载体蛋白(BSA 或OVA)硼酸钠溶液中，l小时内加完，室温搅拌反应过夜。然后，将偶联物过SephadexG—25M凝胶层析纯化，用0.01M pH 7.4 PBS三倍柱床体积 平衡，调节流速至3ml/min，样品浓縮至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联物，洗 脱液用pH7.4 0.01M PBS。 1.3免疫及特异性抗体的制备将上述三聚氰胺-BSA偶联物用生理盐水稀释成lmg/ml溶液备用。选取6只体重2 2.5Kg健康雄性新西兰大白兔。将偶联物与等量弗氏完全佐剂通过注射 器对抽法混合成油包水的乳浊液，按lmg/Kg体重的量进行首次免疫，采取背部皮下多点注 射。每隔两周加强免疫一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及方法同首次免疫。 从第三次免疫开始，每次免疫后10天，耳缘静脉取血lml,进行抗体效价检测，当抗体效价 不再升高时，不加佐剂进行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后颈动脉放血，室 温凝固2 h后4'C过夜，8000 r/min离心10分钟，除去血块，血清部分用50%饱和硫酸铵 溶液沉淀，离心去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33%饱和硫酸铵溶液沉淀两次， 沉淀物用尽可能少的磷酸缓冲液溶解，经透析后用S印hadexG-25M层析，即得多克隆抗体。 实施例2免疫检测方法的建立2.1 ELISA方阵法确定最佳反应浓度将lOOOu g/ml、 100 ti 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测三聚氰胺的直接竞争法酶联免疫试剂盒，其中包括：三聚氰胺特异性抗体、三聚氰胺标准品和酶标记三聚氰胺。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨曙明，于洪侠，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：11
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