本发明专利技术公开了一种抗猪瘟病毒野毒株Ｅ２蛋白的单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本发明专利技术采用环磷酰胺免疫抑制法，用杆状病毒表达的猪瘟兔化弱毒疫苗株Ｅ２蛋白作为耐受原，以石门株Ｅ２蛋白作为免疫原，免疫小鼠，经细胞融合，筛选得到稳定分泌抗Ｅ２蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该单克隆抗体能与石门株发生反应，同时能与１．１、２．１、２．２和２．３基因亚群猪瘟病毒野毒株发生特异性反应，并具有中和活性，而与猪瘟兔化弱毒疫苗株不发生反应。本发明专利技术单克隆抗体可用于鉴别猪瘟病毒野毒株和猪瘟兔化弱毒疫苗株，为建立一种区分猪瘟野毒感染与疫苗免疫的方法以及研究ＣＳＦＶ强毒和弱毒之间的分子差异奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及单克隆抗体，尤其涉及一种抗猪瘟病毒野毒株E2蛋白的单克隆 抗体，本专利技术还涉及分泌该抗E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及该单克隆 抗体在猪瘟临床诊断中的应用，属于动物疾病检验检疫领域。
技术介绍
猪瘤(Classical swine fever， CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever vims， CSFV)引起的一种以高热和出血为特征的高度接触性传染病，是危害养猪业的 重大传染病之一，世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疾病名录(O正Listed diseases),我国也将其列为一类传染病。CSFV属于黄病毒科(F/aWvzWt/"e)瘟病 毒属(/V幼'wVm)，其基因组为线状单股正链RNA，长约12.3kb，含有一个大的 开放阅读框架(ORF)，由其编码一条约3898个氨基酸的多聚蛋白，在病毒和宿 主细胞蛋白酶的作用下，多聚蛋白在翻译和翻译后加工过程中形成12种成熟的 病毒蛋白，包括4种结构蛋白(C、 E，、 E1和E2)以及8种非结构蛋白(Np 、 p7、 NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A和NS5B) (Rice CM. Flaviviridae: the viruses and their replication. In: Knipe DM, Fields BN, and Howley P, eds. Fundamental Virology, Philadelphia: Lippincott-Rave Publishers, 1996: 931-959)，其中E2囊膜糖蛋白编码 373个氨基酸残基，是CSFV诱导机体产生中和抗体的主要抗原(RumenapfT, Meyers Q Stark R， " <a/. Hog cholera virus—Characterization of specific antiserum and identification of cDNA clones. Virology, 1989, 171(1): 18-27)。目前，在猪瘟流行的国家控制猪瘟应用最广泛的还是接种猪瘟弱毒疫苗。 而常规弱毒疫苗免疫的最大缺点是难以用血清学方法与自然感染区分开。国内外学者已经制备了多种CSFV单克隆抗体(Wensvoort G, Terpstra C， Boonstra J， dProduction of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis. Vet Microbiol, 1986, 12(2):101-108;丘惠深，王在 时，方国安.猪瘟单克隆抗体诊断试剂的研究.中国畜禽传染病，1991, 6:20-26; 1991,6:20-26;马刚，李作生，余兴龙等.猪瘟病毒保护性抗原E2 蛋白单抗的制备及其抗原表位的初步分析.中国兽医学报,2002, 22(2):121-124;杨艳艳，张改平，王选年.猪瘟病毒单克隆抗体的制备及其 免疫组织化学研究.中国兽医科学,2006,36(10):782-786;侯强，彭伍平， 孙元等.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及其单克隆抗体 的制备.中国兽医科学,2008，38(1):1-5.)，然而由于猪瘟野毒株和弱毒疫苗株 的同源性很高，大多数单克隆抗体与猪瘟病毒野毒株和弱毒株都可以反应，无 法有效区分野毒感染与疫苗毒，很大程度上限制了CSFV单克隆抗体在猪瘟临床 诊断中的应用。从80年代后期开始，国内外学者对于不易纯化的抗原、与其它蛋白具有高 相似性的蛋白(抗原)和弱免疫原性的抗原制备单克隆抗体时使用扣减免疫技 术(Subtractive immunization techniques),并取得了令人满意的效果(Matthew WD: Sandrock AW Jr. Cyclophosphamide treatment used to manipulate the immune response for the production of monoclonal antibodies. J Immunol Methods, 1987， 100 (l-2):73-82; Weiland E, Thiel HJ, Hess G， & a/. Development of monoclonal neutralizing antibodies against bovine viral diarrhea virus after pretreatment of mice with normal bovine cells and cyclophosphamide. J Virol Methods, 1989,24( 1 -2):23 7-43; Salata RA, Malhotra IJ, Hampson RK, ef a/. Application of an immune-tolerizing procedure to generate monoclonal antibodies specific to an alternate protein isoform of bovine growth hormone. Anal Biochem, 1992, 207(l》142-9;陆芹章.免疫抑制法制备单克隆抗体的研究.中国免疫学杂志， 1994, 10(6》350-353;钱建飞，毛洪先，邵国青等.环磷酰胺免疫抑制法制备单克 隆抗体的研究.中国农业科学，1996,29(3):86-92)，该技术主要包括3种方法新 生动物耐受(Neonatal tolerization)、高带耐受(High zone tolerization)与药物免 疫抑制(Chemical immunosuppression)。药物免疫抑制中的常用药物是环磷酰胺 (Cyclophosphamide; Cy)，因此该方法又常称为环磷酰胺免疫抑制。环磷酰胺 是一种非特异性免疫抑制剂，与抗原联用时能优先杀死针对外来抗原迅速增殖 的B、 T淋巴细胞克隆，并诱导机体在一定时期内对该抗原产生特异性免疫耐受， 而不影响机体免疫系统对其它抗原的识别。制备一种仅与猪瘟野毒株反应而与兔化弱毒疫苗株不反应的单克隆抗体， 对于建立一种区分猪瘟野毒感染与疫苗接种的诊断方法以及研究猪瘟强毒和弱 毒之间的分子差异均具有重要的意义。
技术实现思路
此前，本专利技术人利用杆状病毒表达系统表达了具有生物学活性的CSFV强毒 和弱毒株E2蛋白(彭伍平，夏照和，侯强，等.猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒 疫苗株E2蛋白糖基化位点差异分析.病毒学报,2007,23(5):389-393)，在此基础 上，本专利技术利用环磷酰胺免疫抑制法制备了一株仅与猪瘟野毒株反应而与兔化 弱毒疫苗株不反应的单克隆抗体。具体来说，本专利技术采用环磷酰胺免疫抑制法， 用杆状病毒表达的猪瘟兔化弱毒疫苗株E2蛋白(HCLV-E2)作为耐受原，以石门株E2蛋白(Shimen-E2)作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾淋巴细胞与本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株分泌抗猪瘟病毒野毒株Ｅ２蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其微生物保藏号是：ＣＧＭＣＣＮＯ．２４５５。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：仇华吉，夏照和，彭伍平，成丹，侯强，王万利，孙元，涂长春，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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