本发明专利技术提供了一种检测猪囊尾蚴抗体的间接ＥＬＩＳＡ试剂盒及其制备方法与应用。该试剂盒包括以基因工程表达的猪囊尾蚴ＴＳ－ＣＣ１８蛋白作为包被抗原的ＥＬＩＳＡ板条，ＰＢＳＴ洗液，血清稀释液，辣根过氧化物酶标记的兔抗猪ＩｇＧ、显色底物、终止液及猪囊尾蚴标准阴阳性血清等。所用的重组抗原的制备是将编码猪囊尾蚴ＴＳ－ＣＣ１８基因的片断与表达载体ＰＥＴ２８ａ（＋）连接，并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）进行诱导表达；表达蛋白经镍柱亲和纯化后包被酶标板。本发明专利技术的优势体现在具有良好的特异性和敏感性、检测成本低廉、操作简单、可大量生产以及生产周期短等优点，有着良好的推广应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪囊尾蚴病抗体检测试剂盒的制备方法与应用。尤其是一 种重组诊断抗原及检测猪囊尾呦抗体的酶联免疫试剂盒的制备方法及应用。
技术介绍
猪囊尾呦病(Cysticercosis)是由猪带绦虫(r"em'a 的幼虫一猪囊尾蚴(qy幼'c^rw "〃"/w^)感染猪或人而引起的一种人兽共患的食源性寄生 虫病。该病危害严重、分布广泛，在大多数发展中国家是一个重要的公共卫生 问题。近年来由于移民的大量流动， 一些发达国家也有人患猪囊尾蚴病的报道， 甚至在美国该病也有重新抬头的趋势。人感染猪囊尾蚴后，以脑囊虫病的发病 率最高，危害性最大，通常引发癫痫、失明等症状，如不及时治疗或治疗不当 往往会使人致残甚至危及生命。另外囊尾呦病还严重制约着养猪业及肉食品加 工业的发展。对于囊尾蚴病的防治，目前尚无成熟的手段。化学药物如丙硫苯咪唑和吡 喹酮对囊尾蚴有驱除和治疗的作用，但长期使用虫体易产生耐药性，且药物残 留对人体健康构成潜在威胁，因而药物治疗具有局限性。囊尾蚴抗原、六钩蚴 分泌抗原都能诱导机体产生抗体，具有一定的保护作用且均可作为诊断抗原， 但这些抗原都来自于虫体本身，因而抗原来源十分有限，不能满足实际生产的 需要。随着分子生物学技术在寄生虫领域的应用，人们开始克隆抗原基因并在 体外表达，进而研制疫苗或诊断试剂盒，解决抗原来源有限的难题，为囊尾蚴 病的预防和诊断开辟了 一条新的途径。早期的抗体诊断方法，如间接血凝试验、补体结合试验等缺乏特异性和敏 感性。但是在1989年，Tsang等首先用小扁豆植物血凝素亲合层析柱纯化了全 囊抗原，得到了分子量为13 50kD的一组糖蛋白(LLGP)，并以此建立了酶联免 疫印渍》去(enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay, ELIB)。 i亥方》去具有f艮 高的特异性及敏感性，现已成为国际和泛美卫生组织公认的囊虫病血清学诊断 的"金禾示准"。(Kathy Hancock, Azra Khan, Fatima B. ^Villiams, d <a/. Characterization of the 8-Kilodalton Antigens of T^ewz'a so/Zww Metacestodes and Evaluation of Their Use in an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay forSerodiagnosis .Journal of Clinical Microbiology.2003,41(6): 2577-2586.) LLGP 成分包括50kD、 39~42kD、 24kD、 21kD、 18kD、 14kD和13kD共7种糖蛋白 条带组分。这些成分包括了六钩呦及囊尾呦期的阶段特异性抗原。然而该方法的建立依赖于囊尾蚴天然抗原，抗原制备繁琐、成本高，试验 操作要求素质较高的专业技术人员；部分纯化的LLGP抗原不适于ELISA方法， 其Western blot方法也不适于进行野外试验或者囊尾呦病流行的国家。基于上述 原因，国外学者对7种LLGP诊断抗原组分进行了系统鉴定，目前已报道的诊 断抗原主要有8kD蛋白家族，参见Kathy Hancock, Azra Khan, Fatima B.Williams, W a/. Characterization of the 8-Kilodalton Antigens of T^emV so/Z謂 Metacestodes and Evaluation of Their Use in an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Serodiagnosis .Journal of Clinical Microbiology, 2003, 41(6): 2577 2586; 10kD蛋白，参见Chung JY， Bahk YY, Huh S, " a/. A recombinant 10kDa protein of T^e"/a so/Z画 metacestodes specific to active neurocysticercosis.The Journal of Infectious disease, 2000, 181(5):1870 1872; 14kD/l 8kD蛋白，参见Marcia Ramos Monteiro da Silva, Ant6nio Augusto Mendes Maia， d a/. Recombinant expression of T^em'a so/z'誦TS14 antigen and its utilization for immunodiagnosis of neurocysticercosis.Acta Tropica, 2006, 100 (3): 192 198; T24/42kD蛋白，参见Kathy Hancock, Sowmya Pattabhi, Fatima W， d a/. Characterization and cloning of T24, a T^em'a raZ/ww antigen diagnostic for cysticercosis . Molecular and Biochemical Parasitology, 2006， 147(1): 109~117; GP50蛋白，参见Kathy Hancock Sowmya Pattabhi , Ryan M. Greene , d Characterization and cloning of GP50, a T^em'a so/Z訓antigen diagnostic forcysticercosis .Molecular and Biochemical Parasitology, 2004, 133 : 115 124等。而且在这些研究中，14kD/18kD具有较好的特异性及敏感性，被认为最适合作为 囊尾蚴病的诊断抗原。国内目前均参照国家质量监督检验检疫总局发布的猪囊尾蚴病诊断的国家 标准(GB/T 18644-2002)生产猪囊尾呦病ELISA诊断试剂。另外，中国专利技术专 利申请2003113564.1公开了一种食源性寄生虫病快速酶免疫检测方法及检测 盒，该申请中包含有猪囊虫病的诊断方法。但是所用的诊断抗原均为囊液抗原 或虫体抗原，存在的突出问题是抗原来源困难，纯化繁琐，难以标准化，且易 于出现假阳性或假阴性的问题。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种可以克服现有技术不足，以重组蛋白为诊断抗原建立间接酶联免疫吸附(ELISA)检测猪囊尾蚴抗体的检测试剂盒和检测方法，本 专利技术同时提供检测试剂盒中包被抗原的重组蛋白TS-CC18的制备方法和基因序 列。本专利技术提供的猪囊尾呦病检测试剂盒包括a以猪带绦虫囊尾蚴18kD基因的重组蛋白TS-CC18为包被抗原的固相载 体的抗原包被板；b洗涤液，例如采用含有Tween-20的磷酸盐缓冲液为洗涤液，或者采用 Tris-盐酸洗涤液；c样品稀释液，例如采用适当浓度的异种动物血清，或者是如PEG6000， 明本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪囊尾蚴病间接ＥＬＩＳＡ检测试剂盒，其特征是检测试剂盒包括： ａ以猪带绦虫囊尾蚴１８ｋＤ基因的重组蛋白ＴＳ－ＣＣ１８为包被抗原的固相载体的抗原包被板； ｂ洗涤液； ｃ样品稀释液； ｄ标准阴阳性猪血清； ｅ兔抗猪ＩｇＧ－ＨＲＰ； ｆ底物溶液Ａ： ｇ底物溶液Ｂ ｈ显色剂； ｉ过氧化氢水溶液； ｊ终止液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：才学鹏，张少华，景志忠，骆学农，郭爱疆，郑亚东，贾万忠，窦永喜，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]
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