一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种ＲｈｏＧＤＩ２（Ｒｈｏ　ＧＤＰ　ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｂｅｔａ）基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用。所述的试剂盒包括杂交探针、标记物、杂交液、增效剂，其中所述的杂交探针序列如ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０．１所示。一种ＲｈｏＧＤＩ２基因的原位杂交检测方法包括以下步骤：ａ．将试剂盒中的杂交探针与底物中待测ＲＮＡ接触，形成杂交复合体；ｂ．检测ａ步骤得到的杂交复合体。所述的试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用。本发明专利技术提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。同时，本发明专利技术的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种试剂盒，具体地说关于一种RhoGDI2基因的原位杂交 ;险测试剂盒及其检测方法和应用。
技术介绍
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数170万， 死亡人数近160万，患者600多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡 人数接近800万，患者约有8400多万人，到2020年以上人数将翻一番， 这是一组可怕的数字。2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个 年度报告，"认为人类在抗癌大战中是失败"，也就是说癌症死亡率没有降 低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是1、肿瘤细胞异质性；2、 肿瘤细胞耐药性；3、抗癌药物设计思路不完善等。同时，该报告中亦提 出应重新审视现有诊治癌症的措施。本专利技术人在研究中发现，导致癌症死 亡率不降的另二个重要原因是1、不能做到真正的早期诊断；2、转移的病理机制不清楚。依照传统的医学影4象及和其它生化(如蛋白标记物)指标 来诊断癌症，认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些 有时无症状体征)，这一临床概念值得认真讨论。影1象医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度，l公分的肿块约有一亿个胂瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿 个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病 理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，4艮难证实的是在 这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上已证实一 旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长； 一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此， 在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例， 在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时 已经是晚期了，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的 深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌 变前期或癌细胞形成(单克隆)时或癌细^^包突-皮血管壁早期转移时，就能 做到早期预测诊断。弗吉尼亚大学的泌尿学与分子生理学教授Dan Theodorescu 博士领导的科学小组研究表明，RhoGDI2基因与膀胱癌细胞转移 有关系，当RhoGDI2基因在癌细胞中有活性时，细胞就产生一种 能够阻止癌细胞浸入到其他器官的蛋白。目前对RhoGDI2基因的研究都釆用高通量基因芯片技术，而这些方法 多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化的应用在我国现阶段条 件尚不成熟。原位杂交技术Un situ hybridization)是将分子生物学与细月包化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是〗吏含有特异序列、经过标记的核酸单链(即揮: 针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即耙核貌义生杂交，再 以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DM或RNA分子。原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分 子(虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按 核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸 探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的抬r 测。常用的标记物包括》文射性核素和非;^文射性标记物两大类。常用的同位 素标记物有3H、 35S、 125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底 较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来 有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地 高辛和荧光素三种。；险测这些标记物的方法都是极其灵敏的。根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为 DNA-DNA，RNA-DNA， RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过 五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、沖洗和显示。中国专利文献CN1556410公开了 "一种鱼类病毒的检测试剂盒及其 检测方法"。中国专利文献CN1680597公开了 "一种用于定量检测丙型肝 炎病毒(HCV)的荧光定量PCR试剂盒"。中国专利文献CN2918435，公开了 "一种检测肥胖相关基因SNP的寡核苷酸芯片及试剂盒"。但是，关于 RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒及其4企测技术未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于 (1 )、提供一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒；(2) 、提供一种RhoGDI2基因的原位杂交检测方法；(3) 、提供一种RhoGDI2基因的原位杂交检测试剂盒的应用。 本专利技术的目的是通过以下技术方法来实现的本专利技术人在对大量样本广泛性腺癌(肝、肺、肾、胃、子宫、卵巢、乳房、直肠 等血液细胞)检测中观察到，癌症病人伴有转移者，RhoGDI2基 因表达量降低或大部分是零表达，该指标有重要的临床价值。我 们检测了近800例各种类型癌症患者(大部分已转移)血液标本， 近800例正常对照组人群，经统计学分析，癌症患者体内RhoGDI2 基因表达量为8%左右，正常人群表达量平均为50%,病例组中有 600多例该基因是零表达。同时^r测两个家族性癌症好发家属的 直系亲属，该基因的表达量比正常人表达量都低。本专利技术提供的 肺瘤转移抑制基因RhoGDI2是人类同源基因，位于染色体12P12. 3的一个 Rho家族基因，它们与GTP和GDP-1功能和细胞内移动有关。RhoGDI2在 正常人体组织或器官中广泛表达,但在人类各种类型肺瘤及肺瘤转移患者 中表达明显下降，甚至缺失。这是它与其它肿瘤转移抑制基因不同之处， 具有广谱的癌症转移抑制作用。本专利技术的检测试剂盒是采用核酸杂交技术 和组化免疫方法相结合，以RhoGDI2基因为检测对象，合成探针是RhoGDI2 基因的DNA或RNA序歹。，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供RhoGDI2基因的半定量或 定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，癌 症病人RhoGDI2基因表达低或不表达，即不显色，正常人有50°/。的表达量， 显色深。本专利技术的核酸杂交基本过程包括下列几个步骤。(l)制备样品 首先需要从待检测组织样品提取RNA。 RNA样品则可直接在变性条件下电 泳分离，然后转印并交联固定。(2)制备探针探针是指一段能和待检测 核酸分子^Utt配对原则而结合的核酸片段。在核酸杂交实验中，探针需 要被标记上可直接检测的元素或分子。这样，通过检疫与恩印膜上的核酸 分子结合上的探针分子，既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，也就 是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的分子大小。本试剂盒中探针用地 高辛标记。(3)杂交首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜 上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子， 所以杂交过程中只需变性标记好的探针,再让探针与膜在特定的温度下反 应，然后洗去未结合的探针分子即可。(4)检测用相应的免疫组织化学 的方法进行4全测。具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染 色、镜下进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＲｈｏＧＤＩ２基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、杂交液、增效剂，其特征在于：所述的杂交探针序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张云福，裘建英，
申请(专利权)人：芮屈生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]