抗肿瘤靶向融合蛋白、其偶联物及用途制造技术

本发明专利技术涉及抗肿瘤靶向融合蛋白、其偶联物及用途。该抗肿瘤靶向融合蛋白由从N端到C端按式I或式II构造的序列构成。式I：PsTag‑Linker‑CPP‑KLAC；式II：KLAC‑CPP‑Linker‑PsTag。该偶联物为抗肿瘤靶向融合蛋白经其偶联位点与抗肿瘤化合物偶联而成，偶联位点为KLAC中的半胱氨酸。该抗肿瘤靶向融合蛋白不仅有明显改善的药代动力学性质，还具有明显的肿瘤靶向性；该偶联物可实现以两种不同抗肿瘤机制对肿瘤细胞进行协同杀伤，并通过抑制ATP的产生降低肿瘤细胞对药物的外排作用，形成逆转耐药作用，以此显著提高药效；该偶联物还能降低或消除所偶联抗肿瘤化合物的心肌细胞毒性。

【技术实现步骤摘要】
抗肿瘤靶向融合蛋白、其偶联物及用途
本专利技术涉及抗肿瘤靶向融合蛋白、其偶联物及用途，属于长效靶向抗肿瘤药物研究领域。
技术介绍
据申请人所知，药物治疗依然是现在癌症治疗中主要手段之一，但是常常由于耐药性的产生而导致治疗失败，因此除了进一步增强药效和降低毒性，抗肿瘤药物的耐药成为目前抗肿瘤领域最主要的研究问题之一。肿瘤细胞产生耐药性的主要原因之一，是ABC转运体(即ATP依赖性的转运蛋白)的过度表达，因此通过直接减少细胞ATP的产生是逆转多重耐药的更为直接有效的方法。线粒体是真核细胞产生ATP的重要细胞器，通过直接破坏耐药肿瘤细胞的线粒体，可以有效阻碍细胞内ATP的产生。近年来，治疗性多肽在抗微生物、抗肿瘤以及在生物医学材料中表现出了巨大的应用前景而备受关注；其中，KLA是一种被广泛研究的能够破坏线粒体的生物活性肽。KLA的作用机制是通过破坏线粒体外膜，导致合成ATP的功能紊乱，并能使细胞色素C外漏到细胞质中，进一步激活死亡信号蛋白促进细胞凋亡。虽然KLA可以有效的破坏肿瘤细胞线粒体并使其凋亡，但由于缺乏靶向性、以及极短的体内半衰期等问题，限制了其进一步的开发。PEG修饰(PEGylation)已广泛应用于延长治疗性多肽的半衰期。PEG修饰改变了生物医学分子的理化性质，例如其构象、静电结合和疏水性，从而带来该药物在药代动力学行为上的改进。一般而言，PEG修饰能够改善药物溶解度，降低免疫原性。而且，PEG修饰不仅能够延长药物半衰期，还能通过EPR效应被动靶向至肿瘤组织，增加药物在肿瘤部位的分布。此外，PEG修饰位点需要小心确定，以避免干扰治疗性融合多肽的活性位点。再者，PEG是相关聚合物的非均匀混合物，其缀合至抗肿瘤多肽或蛋白会产生具有类似的分子大小和化学性质的许多不同化学物种。这会令纯化变得复杂，并增加PEG修饰产物的生产成本。更严重的问题是发现长期使用PEG后，PEG会在组织中蓄积，严重时可对肾脏造成损伤。因此，亟待研发能克服上述问题的新技术手段。专利技术人所在课题组已于2015.10.15申请了中国专利技术专利申请(申请号为201510675827.7，申请公布号为CN105524147A)，利用建库筛选的方法得到成系列的重组聚多肽，可通过与生物活性蛋白质融合表达，成为一种PEG修饰的替代方法，聚多肽融合蛋白具有增强稳定性、延长半衰期、降低免疫原性、不改变生物活性等诸多优点。在此基础上，专利技术人课题组有了更进一步的研究成果。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提出抗肿瘤靶向融合蛋白，能改善抗肿瘤药物的肿瘤靶向性和药代动力学性质；同时，还提出以该融合蛋白为基础的偶联物，具有抗肿瘤作用；还提出该融合蛋白及偶联物的用途。本专利技术解决其技术问题的技术方案如下：抗肿瘤靶向融合蛋白，其特征是，由从N端到C端按式I或式II构造的序列构成：式I：PsTag-Linker-CPP-KLAC；式II：KLAC-CPP-Linker-PsTag；在式I或式II中，PsTag为重组聚多肽，由100至5000个氨基酸残基构成，其中，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸以及赖氨酸的总数量合计占总氨基酸残基数量的95％以上；根据GOR算法确定，在该重组聚多肽的结构中，有至少95％为无规则卷曲；根据Chou-Fasman算法确定，在该重组聚多肽的结构中，α螺旋和β折叠所占比例的总和小于2％；该重组聚多肽的序列中最多含有1个甲硫氨酸；Linker为连接肽，所述连接肽具有MMP2酶切位点序列；CPP为细胞穿膜肽；KLAC为抗肿瘤多肽。优选地，所述MMP2酶切位点序列为PLGLAG；所述连接肽的序列为：EEEEEEEEPLGLAG、PLGLAGEEEEEEEE、或PLGLAG。优选地，所述细胞穿膜肽选自R8、TAT、MPG、Transportan、Pep-1、EB1、Tat-DRBD之一，或者所述细胞穿膜肽含有R8、TAT、MPG、Transportan、Pep-1、EB1、Tat-DRBD中的至少一个；R8序列为：RRRRRRRR；TAT序列为：GRKKRRQRRRPPQ；MPG序列为：GLAFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV；Transportan序列为：AGYLLGKINLKALAALAKKIL；Pep-1序列为：KETWWETWWTEWSQPKKKRKV；EB1序列为：LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK；Tat-DRBD序列为：YGRKKRRQRRR-AGDLSAGFFMEELNTYRQKQGVVLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIIDGREFPEGEGRSKKEAKNAAAKLAVEILNKEKKA。优选地，所述重组聚多肽的序列如SEQIDNo.2至SEQIDNo.20所示。本专利技术还提出：编码前文所述抗肿瘤靶向融合蛋白的核酸。含有前文所述核酸的表达载体。含有前文所述表达载体的宿主细胞。本专利技术还提出：抗肿瘤靶向融合蛋白偶联物，其特征是，由前文所述抗肿瘤靶向融合蛋白经其偶联位点与抗肿瘤化合物偶联而成，所述偶联位点为KLAC中的半胱氨酸。优选地，所述抗肿瘤化合物为阿霉素或其衍生物、紫杉醇或其衍生物、美登素或其衍生物、或者海兔毒素或其衍生物。更优选地，所述阿霉素衍生物的结构如式A或式B或式C所示：所述紫杉醇衍生物的结构如式D或式E所示：所述美登素衍生物的结构如式F或式G所示：所述海兔毒素衍生物的结构如式H或式J所示：本专利技术还提出：前文所述抗肿瘤靶向融合蛋白的用途，其特征是，所述用途为用于制备治疗或预防肿瘤的药物或药物组合物，或者用于制备抗肿瘤靶向融合蛋白偶联物，或者用于通过与阿霉素偶联来制备心肌细胞毒性低于阿霉素的抗肿瘤靶向融合蛋白-阿霉素偶联物。前文所述抗肿瘤靶向融合蛋白偶联物的用途，其特征是，所述用途为用于制备治疗或预防肿瘤的药物或药物组合物，或者用于制备心肌细胞毒性低于阿霉素的含抗肿瘤靶向融合蛋白-阿霉素偶联物的药物或药物组合物。优选地，所述肿瘤为ABC转运体过表达导致的耐药肿瘤。专利技术人课题组在实践研究中获知，肿瘤细胞的微环境与正常细胞之间存在着显著的差异，例如异常的血管、氧化性、灌注作用、pH和代谢状态等，这样即可利用肿瘤微环境开发药物靶向递送系统用来在肿瘤部位释放药物。MMP2是一种肿瘤组织过表达的蛋白酶，专利技术人课题组经研究后决定采用MMP2酶切位点序列(尤其是“PLGLAG”序列)，将其与CPP相结合，以期望整个融合蛋白能在肿瘤微环境中被切割释放活性组分，即抗肿瘤多肽KLAC。同时，PsTag(重组聚多肽)是专利技术人课题组之前的研究成果，专利技术人课题组将其放入上述融合蛋白的结构中，以期望改善抗肿瘤多肽KLAC的药代动力学性质。经实验证实，与抗肿瘤多肽KLAC单独给药相比，上述抗肿瘤靶向融本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗肿瘤靶向融合蛋白，其特征是，由从N端到C端按式I或式II构造的序列构成：/n式I：PsTag-Linker-CPP-KLAC；/n式II：KLAC-CPP-Linker-PsTag；/n在式I或式II中，PsTag为重组聚多肽，由100至5000个氨基酸残基构成，其中，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸以及赖氨酸的总数量合计占总氨基酸残基数量的95％以上；根据GOR算法确定，在该重组聚多肽的结构中，有至少95％为无规则卷曲；根据Chou-Fasman算法确定，在该重组聚多肽的结构中，α螺旋和β折叠所占比例的总和小于2％；该重组聚多肽的序列中最多含有1个甲硫氨酸；/nLinker为连接肽，所述连接肽具有MMP2酶切位点序列；CPP为细胞穿膜肽；KLAC为抗肿瘤多肽。/n

【技术特征摘要】
1.抗肿瘤靶向融合蛋白，其特征是，由从N端到C端按式I或式II构造的序列构成：
式I：PsTag-Linker-CPP-KLAC；
式II：KLAC-CPP-Linker-PsTag；
在式I或式II中，PsTag为重组聚多肽，由100至5000个氨基酸残基构成，其中，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸以及赖氨酸的总数量合计占总氨基酸残基数量的95％以上；根据GOR算法确定，在该重组聚多肽的结构中，有至少95％为无规则卷曲；根据Chou-Fasman算法确定，在该重组聚多肽的结构中，α螺旋和β折叠所占比例的总和小于2％；该重组聚多肽的序列中最多含有1个甲硫氨酸；
Linker为连接肽，所述连接肽具有MMP2酶切位点序列；CPP为细胞穿膜肽；KLAC为抗肿瘤多肽。


2.根据权利要求1所述的抗肿瘤靶向融合蛋白，其特征是，所述MMP2酶切位点序列为PLGLAG；所述连接肽的序列为：EEEEEEEEPLGLAG、PLGLAGEEEEEEEE、或PLGLAG。


3.根据权利要求1所述的抗肿瘤靶向融合蛋白，其特征是，所述细胞穿膜肽选自R8、TAT、MPG、Transportan、Pep-1、EB1、Tat-DRBD之一，或者所述细胞穿膜肽含有R8、TAT、MPG、Transportan、Pep-1、EB1、Tat-DRBD中的至少一个；
R8序列为：RRRRRRRR；
TAT序列为：GRKKRRQRRRPPQ；
MPG序列为：GLAFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV；
Transportan序列为：AGYLLGKINLKALAALAKKIL；
Pep-1序列为：KETWWETWWTEWSQPKKKRKV；
EB1序列为：LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK；
Tat-DRBD序列为：YGRKKRRQRRR-AGDLSAGFFMEELNTYRQKQGVVLKYQELPNSGPPHDRRFTFQVIIDGREFPEGEGRSKK...

【专利技术属性】
技术研发人员：高向东，尹骏，刘定康，姚文兵，陈烨，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32