一种免疫效应细胞转换受体制造技术

本发明专利技术提供了一种免疫效应细胞转换受体、其编码核酸、含有其编码核酸的核酸构建体、表达该免疫效应细胞转换受体的免疫效应细胞、含有前述一种或多种的药物组合物和表达该免疫效应细胞转换受体免疫效应细胞的制备方法以及前述中一种或多种在制备抗癌药物中的应用。本发明专利技术提供的免疫效应细胞转换受体与其结合蛋白的相互作用能够有效地刺激表达该免疫效应细胞转换受体的细胞，特别是免疫效应细胞，激活了下游胞内的CD3ζ区的信号传导及通过白激素受体链介导的STAT3转录因子与CD3ζ区STAT5结合基序介导的STAT5转录因子信号通路，能够有效地促进该细胞的增殖与持续，为体内和/或体外刺激并扩增该细胞提供了一种新的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种免疫效应细胞转换受体
本专利技术涉及医学免疫学与分子生物学领域，具体地涉及一种免疫效应细胞转换受体。
技术介绍
免疫细胞治疗技术是近年来收到广泛和深度关注的一项新兴的治疗技术，特别是在用于癌症治疗的用途中。过继性细胞转移(adoptivecelltransfer,ACT)治疗是目前免疫细胞治疗技术治疗肿瘤的一种重要方法。该方法通常包括将细胞表面受体经过基因工程改造后的免疫效应细胞输入至待治疗的病人体内，表面受体经过改造的免疫效应细胞能够特定地靶向并杀伤肿瘤细胞，从而达到抗肿瘤的效果。输入至人体内的改造后的免疫效应细胞可以是自体的，也可以是同种异体的。过继性细胞转移用于治疗实体瘤时显现出一定的疗效，并且显著地具有高度特异性。对过继性免疫治疗的方法产生响应的较好的临床效果通常与被过继性转移的免疫效应细胞的抗肿瘤功能、瘤内迁移和持续存在性直接相关。最初的常见的可被过继性转移的免疫效应细胞主要为TCR经过改造的T细胞。近年来随着免疫细胞治疗技术的快速发展，尤其是CAR-T细胞治疗在研究和临床应用上的突破，其他多种免疫效应细胞也被显示具有能够被改造并被用于ACT治疗肿瘤的潜力。CAR-T细胞的制备通常包括以下几步：1)采集受试者的血液、分离T细胞；2)用CAR基因遗传修饰获得的T细胞；3)对修饰后的T细胞进行刺激/扩增；4)选择性地富集CAR-T细胞；6)对阳性T细胞进行大规模离体扩增；7)浓缩细胞、施用或冻存。已有的研究和临床试验都表明，CAR-T的过继性细胞治疗效果与T细胞在体内增殖与存活能力相关(MiloneMC,FishJD,CarpenitoCetal.ChimericreceptorscontainingCD137signaltransductiondomainsmediateenhancedsurvivalofTcellsandincreasedantileukemicefficacyinvivo.MolTher2009；17:1453–1464；RobbinsPF,DudleyME,WunderlichJetal.Cuttingedge:persistenceoftransferredlymphocyteclonotypescorrelateswithcancerregressioninpatientsreceivingcelltransfertherapy.JImmunol2004；173:7125–7130.)。目前CAR-T细胞免疫疗法所面临的一个主要问题是T细胞与大多数人体的体细胞一样，复制的生命周期非常有限，即存在着复制性衰老(EffrosRB,PawelecG.ReplicativesenescenceofTcells:doestheHayflickLimitleadtoimmuneexhaustion？ImmunolToday1997；18:450–454；ZhouJ,ShenX,HuangJetal.Telomerelengthoftransferredlymphocytescorrelateswithinvivopersistenceandtumorregressioninmelanomapatientsreceivingcelltransfertherapy.JImmunol2005；175:7046–7052.)。虽然在某些病人体内CAR-T细胞展现出长时间的应答(PorterDL,HwangWT,FreyNV,LaceySF,ShawPA,LorenAW,etal.ChimericantigenreceptorTcellspersistandinducesustainedremissionsinrelapsedrefractorychroniclymphocyticleukemia.SciTranslMed(2015)7(303):303ra139)，在其他病人体内其扩增特别是持续只有几周(SchubertML,HuckelhovenA,HoffmannJM,SchmittA,WuchterP,SellnerL,etal.ChimericantigenreceptorTcelltherapytargetingCD19-positiveleukemiaandlymphomainthecontextofstemcelltransplantation.HumGeneTher(2016)27(10):758–71；MausMV,JuneCH.MakingbetterchimericantigenreceptorsforadoptiveT-celltherapy.ClinCancerRes(2016)22(8):1875–84)。除复制性衰老外，影响CAR-T细胞体内增殖和持续的因素还有很多，包括在制备过程中离体培养扩增的条件、外源CAR转基因长期表达的缺失和效应功能差等(KalosM,JuneCH.AdoptiveTcelltransferforcancerimmunotherapyintheeraofsyntheticbiology.Immunity.(2013)39(1):49-60.)。为了克服CAR-T细胞在体内的增殖与持续不足的缺陷，CAR-T细胞在体外扩增的数量上要求也较高，进一步增加了CAR-T细胞制备的成本和难度。在ACT中使用肿瘤浸润淋巴细胞(TumorInfiltratingLymphocyte,TIL)在肿瘤治疗中也被证明是一种非常成功的方法。TILACT能够成功主要原因在于两方面：1)对于自体肿瘤表现出的多样性的抗原特异性；2)能够裂解并根除肿瘤的能力。尽管取得了一定的成功，TIL的ACT疗法仍然面临着挑战。要基因工程修饰TIL使其能够大规模用于临床试验，主要的技术困难之一在于目的TIL在适合GMP的环境下能够被大量扩增。尽管靶向某些肿瘤细胞的TIL，如靶向黑色素瘤的TIL已有报道能在只加入IL-2的条件下成功地大量扩增(DudleyME,WunderlichJR,SheltonTE,EvenJ,RosenbergSAGenerationoftumor-infiltratinglymphocyteculturesforuseinadoptivetransfertherapyformelanomapatients.JImmunother.(2003)26:332–342),其他组织肿瘤来源的TIL，如肾癌来源的TIL，未能一致地重现类似相同水平的扩增(MaloneCC,SchiltzPM,MackintoshAD,BeutelLD,HeinemannFS,DillmanRO.Characterizationofhumantumor-infiltratinglymphocytesexpandedinhollow-fiberbioreactorsforimmunotherapyofcancer.CancerBiotherRadiopharm(2001)16:381–390；MarkelG,Cohen-SinaiT,BesserMJ,OvedK,ItzhakiO,SeidmanR,Fridm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免疫效应细胞转换受体，其特征在于，其包括：1)胞外抗原结构域；2)跨膜结构域；3)胞内共刺激结构域；4)白介素受体链和5)胞内信号传导结构域，其中所述白介素受体链包含内源的或外源的JAK结合基序和STAT5结合基序，所述胞内信号传导结构域包含外源的STAT3结合基序。/n

【技术特征摘要】
1.一种免疫效应细胞转换受体，其特征在于，其包括：1)胞外抗原结构域；2)跨膜结构域；3)胞内共刺激结构域；4)白介素受体链和5)胞内信号传导结构域，其中所述白介素受体链包含内源的或外源的JAK结合基序和STAT5结合基序，所述胞内信号传导结构域包含外源的STAT3结合基序。


2.根据权利要求1所述免疫效应细胞转换受体，其特征在于，所述胞外抗原结构域包含肿瘤抗原；优选地，所述肿瘤抗原包含EGFR胞外区，优选地，所述EGFR胞外区的氨基酸序列为SEQIDNO.3所示；和/或，
所述跨膜结构域选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区中的任一种；优选地，选自CD28跨膜区、CD8跨膜区和CD137跨膜区中的任一种；更优选地，为CD8跨膜区；和/或，
所述胞内共刺激结构域为共刺激信号分子的胞内结构域，选自CD2、CD4、CD8α、CD8β、CD5、CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、Lck、ICOS和DAP10的胞内结构域肽段；优选地，选自CD137/4-1BB和CD28的胞内结构域肽段；更优选地，为CD28胞内结构域肽段；和/或，
所述白介素受体链是或包含白介素受体胞质区片段；优选地，所述白介素受体链是IL-2Rβ或IL-7Rα肽链；更优选地，为IL-2Rβ肽链；最优选地，为截短的IL-2Rβ肽链胞内区，序列为SEQIDNO.4所示；和/或，所述白介素受体链位于所述胞内共刺激结构域和所述胞内信号传导结构域之间；和/或，
所述外源STAT3结合基序是YXXQ，其中所述X为任意氨基酸；优选地，所述外源STAT3结合基序是YRHQ；和/或，所述外源STAT3结合基序距离所述免疫效应细胞转换受体的C末端少于100个氨基酸；和/或，
所述胞内信号传导结构域为免疫受体酪氨酸活化基序，如CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，更优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，其中所述外源STAT3结合基序为第104-107位氨基酸序列。


3.根据权利要求1所述免疫效应细胞转换受体，其特征在于，所述免疫效应细胞转换受体还包括铰链区，所述铰链区位于所述胞外抗原结构域和所述跨膜结构域之间；优选地，所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、IgG1FcCH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28的胞外铰链区、IgG4FcCH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区中的任一种；优选地，所述铰链区是CD8铰链区或IgG4FcCH2CH3铰链区；更优选地，所述铰链区是CD8铰链区。


4.根据权利要求1所述免疫效应细胞转换受体，其特征在于，所述免疫效应细胞转换受体还包含信号肽，所述信号肽任选地位于所述免疫效应细胞受体的N端；优选地，
所述信号肽选自CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽和轻链信号肽中的任一种；优选地，所述信号肽选自CD8信号肽和轻链信号肽中的任一种；更优选地，所述信号肽为CD8信号肽，进一步更优选地，所述CD8信号肽的序列为SEQIDNO.9所示。


5.根据权利要求1-4中任一项所述免疫效应细胞转换受体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。


6.一种分离的核酸，其特征在于，其编码根据权利要求1-5中任一项所述免疫效应细胞转换受体。


7.根据权利要求6所述分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸为RNA；优选地，所述RNA含有5’UTR、编码前述免疫效应细胞转换受体的开放阅读框、3’UTR；更优选地，所述RNA含有5’帽子结构、5’UTR、编码根据权利要求1-6中任一项所述免疫效应细胞转换受体的开放阅读框、3’UTR和polyA序列；或，
所述分离的核酸为DNA，优选地，其序列如SEQIDNO.1所示。


8.一种核酸构建体，其特征在于，其含有根据权利要求6或7所述分离的核酸。


9.根据权利要求8所述核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为含有根据权利要求6或7所述分离的核酸的载体；优选地，所述载体为表达载体；更优选地，所述表达载体为整合载体，如病毒载体或非病毒载体；进一步更优选地，所述非病毒载体为转座子系统载体，任选地为PiggyBac转座子系统载体、SleepingBeauty转座子系统载体、Tn3或Tn5转座子系统载体。


10.一种免疫效应细胞，其特征在于，其表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱其军，刘韬，张洁，黄晨，金华君，
申请(专利权)人：上海细胞治疗集团有限公司，上海细胞治疗研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31