一种具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白FtMT及其制备方法技术

本发明专利技术属重组蛋白制备技术领域，提供一种具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白FtMT及其制备方法。该方法首先以碱性磷酸盐phoA启动子启动、由分泌信号序列modified pel B引导和穿膜肽TatM基因融合，构建了phoA‑TatM‑FtMT重组表达载体重组表达质粒；转入大肠杆菌BL21，构建了工程菌株phoA‑TatM‑FtMT/BL21；经Neidhardt低磷培养基低温诱导表达后，利用Ni

A soluble recombinant tartary buckwheat metallothionein FtMt with membrane penetrating activity and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白FtMT及其制备方法
本专利技术属于重组蛋白制备
，具体涉及一种具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白FtMT及其制备方法。
技术介绍
MT（Metallothionein，MT）是一类广泛存在于生物界，分子量较低(6~7kDa)，富含半胱氨酸，缺少芳香族氨基酸和组氨酸，且能与多种重金属结合的热稳定胞内蛋白质。早在1957年，哈佛大学的Margoshes和Vallee教授在研究马肾脏镉蓄积的过程中分离获得一种含锌和镉的蛋白质，1960年Kagi和vallee将这种特殊的蛋白质首次正式命名为金属硫蛋白（Metallothionein）。此后陆续在多种哺乳动物组织器官、高等植物、真核微生物及原核生物中均发现并分离获得MT蛋白。深入的研究进一步证实多数物种内存在1个以上具有不同氨基酸组成和蛋白特性的MT亚型（isoform）。MT蛋白存在的广泛性、多态性，高度诱导性以及保守性，均暗示其可能在生物体内具有极其重要的生理功能。已有研究表明，金属硫蛋白具有解除重金属毒性、调节必需金属元素平衡、清除自由基、拮抗电离辐射等多种生物学功能，在医药、保健品、化妆品及环保领域具有广阔的应用前景。金属硫蛋白的规模化制备是其应用开发的前提。现有的金属硫蛋白主要通过哺乳动物肝脏提取获得，也有部分从酵母菌、脉孢菌或虫草菌等微生物中提取的报道，但都不同程度存在产量低、成本高、工艺复杂以及生物安全性、生态友好性差等问题（参见CN1583790A；CN1130687A；CN118098A；CN102199645A）。随着基因重组技术的发展，利用成熟和高效的大肠杆菌表达系统制备重组蛋白成为获得大量MT蛋白的首选。然而，近年来虽已有多种来源的MT获得了重组表达，但由于MT独特的性质，其重组制备工艺依然存在诸多问题。首先，MT分子量较小、半衰期短，在大肠杆菌体内不稳定且易被酶降解；其次，MT富含半胱氨酸，极易形成无生物活性的包涵体；第三，MT具有很强的金属结合特性，易螯合体内必需金属元素而对宿主细胞产生较大的毒性（Shahpiri,A.,Mohammadzadeh,A..MercuryremovalbyengineeredEscherichiacolicellsexpressingdifferentricemetallothioneinisoforms.Ann.Microbiol.2018,68,145-152）。目前研究者多通过将MT融合于GST、MBP、SUMO等促溶标签来实现重组表达，或融合外膜蛋白LamB、OmpA或跨膜蛋白PAL将重组MT定位于细胞外膜来降低毒性、防止降解（Mejáre,M.,Bülow,L..Metal-bindingproteinsandpeptidesinbioremediationandphytoremediationofheavymetals.TrendsBiotechnol.2001,19,67-73）。这两种重组表达策略虽然从一定程度上解决了MT表达障碍、效率及可溶性的问题，但均需融合较大的外源基因片段而实现。基于使用安全性和功能完整性考虑，后期需要复杂的蛋白酶切等工艺处理才能去除融合标签，而蛋白酶又比较昂贵，大大限制了其使用。MT作为一种定位于胞内的非信号类蛋白，其临床应用和功能研究受制于其跨膜转导障碍而无法深入展开。穿膜肽（cell-penetratingpeptides，CPPs），又称蛋白转导域(proteintransductiondomain，PTD)，是近年来发现的一种在蛋白转导过程中能高效穿过细胞膜或组织屏障的短肽，能将与其共价连接的蛋白质、RNA和DNA等生物大分子跨膜导入几乎所有的组织和细胞，同时保持其生物活性且不损伤细胞。穿膜肽介导广谱的跨膜作用，突破了基因工程蛋白必须是胞外蛋白的限制，抑或只能通过细胞表面受体和信号转导途径传递生物信息的规律，为蛋白质治疗开辟了新的视野。其中来源于HIV-1病毒编码的一段富含碱性氨基酸序列的多肽Tat，是最早被发现并被广泛应用于胞内运送蛋白分子的细胞膜穿透肽。研究证实，穿膜肽Tat的穿膜活性主要是由其富含碱性氨基酸的特性所决定的，且一定范围内碱性氨基酸比例越高、极性越大，其穿膜活性越强（李思,翟逸舟,陆玉婷,等.一种用于肿瘤药物治疗的新型人源性穿膜肽的优化及其应用,中国生物工程杂志,2018,38(7):40-49）。然而，典型穿膜肽所富含的赖氨酸、精氨酸等极性氨基酸在高效发挥穿膜内化作用的同时，却在大肠杆菌高效表达时由于过高的极性使重组蛋白难以保持可溶形式（张楠,白银,赵景壮,等.多聚精氨酸融合增强型绿色荧光蛋白制备方法及穿膜效果,生物工程学报,2013,29(11):1644-1653）。张楠等人研究表明，通过融合SUMO等促溶标签同样可以解决穿膜肽高含量碱性氨基酸所导致的包涵体问题（张楠,白银,赵景壮,等.多聚精氨酸融合增强型绿色荧光蛋白制备方法及穿膜效果,生物工程学报,2013,29(11):1644-1653），鉴于其安全性考虑需要利用较为昂贵的蛋白酶进行复杂的酶切、纯化处理，同样存在工艺复杂、成本较高的问题，无法应用于产业化生产。MT独特的蛋白特性以及穿膜肽的高含量极性氨基酸组成，导致其重组表达极易形成包涵体，成为其可溶表达的两大限制因素。专利ZL201310430331.4以含有phoA启动子及可分泌至细胞周质的信号肽序列的phoA质粒作为表达载体，建立了一种可溶性重组华溪蟹金属硫蛋白（rcMT）的制备方法，较好的解决了小分子MT蛋白可溶性表达的技术问题。然而，具有穿膜活性的重组穿膜肽-MT融合蛋白同时受限于MT蛋白特性和穿膜肽高含量极性氨基酸组成影响，其可溶表达问题尚未解决。与动物MT相比，植物具有更高含量的活性巯基，极易被氧化，导致植物MT的分离纯化非常困难，大大限制了植物MT的研究和开发。苦荞(Tartarybuckwheat)属于寥科(polygonaceae)，荞麦属(FagopyrumMill)，是一种起源于我国而广泛分布种植于东北亚、东欧等高寒地区的粮食和经济作物。苦荞食药兼用，富含生物类黄酮、活性蛋白、氨基酸、脂肪酸、膳食纤维、微量元素等，具有抗氧化、抗血栓、降血压及增强免疫力等多种营养、保健和药用功能。作为一种抗逆性表现良好的“食药同源”作物，苦荞金属硫蛋白（FtMT）在重金属解毒、抗氧化应激等方面具有广阔的应用前景。然而，关于具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白（FtMT）的制备问题，现有技术尚未能解决。
技术实现思路
本专利技术目的是克服上述已有技术的不足，提供一种具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白FtMT及其制备方法。本专利技术由如下技术方案实现的：一种具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白FtMT，所述重组苦荞金属硫蛋白FtMT编码区基因，由231个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；编码77个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；所述TatM，由来源于HIV-1病毒穿膜肽Tat改造而来，以弱极性赖氨酸部分取代强极性的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白FtMT，其特征在于：所述重组苦荞金属硫蛋白FtMT编码区基因，由231个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；编码77个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；/n所述TatM，由来源于HIV-1 病毒穿膜肽Tat改造而来，以弱极性赖氨酸部分取代强极性的精氨酸，同时保持高穿膜活性；由33个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；编码11个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白FtMT，其特征在于：所述重组苦荞金属硫蛋白FtMT编码区基因，由231个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；编码77个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示；
所述TatM，由来源于HIV-1病毒穿膜肽Tat改造而来，以弱极性赖氨酸部分取代强极性的精氨酸，同时保持高穿膜活性；由33个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；编码11个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。


2.制备权利要求1所述的具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白FtMT，其特征在于：以碱性磷酸盐phoA启动子启动、由分泌信号序列modifiedpelB引导和穿膜肽TatM基因融合，构建phoA-TatM-FtMT重组表达质粒；重组表达质粒转入大肠杆菌BL21，构建了工程菌株phoA-TatM-FtMT/BL21；经Neidhardt低磷培养基低温诱导表达后，利用Ni2+sepharoseTM6FastFlow层析柱分离纯化，获得具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白。


3.根据权利要求2所述的制备具有穿膜活性的可溶性重组苦荞金属硫蛋白FtMT，其特征在于：具体步骤如下：
（1）构建phoA-TatM-FtMT重组表达载体：根据苦荞金属硫蛋白FtMT编码区基因和TatM编码序列，体外化学合成法合成Tat-M-FtMT；以Tat-M-FtMT为模板，以特异性引物进行PCR扩增，引物如下：phoA-TatM-FtMT-F含NcoI酶切位点：5′-GCCATGGCCTATGGCAGGAAGAAG-3′；phoA-TatM-FtMT-R含BamHI酶切位点：5′-AGGATCCGCAGTTGCAGGGATTGC-3′；
扩增产物和phoA质粒经NcoI和BamHI双酶切后，T4DNA连接酶连接后转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取阳性克隆摇菌，进行菌落PCR及质粒酶切鉴定，DNA测序；
所述phoA质粒，多克隆位点C端具有6histag标签，由碱性磷酸盐phoA启动子启动，含分泌信号序列modifiedpelB基因，由57个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQIDNO：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：何永吉，李云龙，卢晓霞，李红梅，胡俊君，程哲，郭洪，李琪，
申请(专利权)人：山西省农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：山西;14