一种细菌素PZJ5杂合肽C-P1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种细菌素PZJ5杂合肽C‑P1，其氨基酸序列为：VKWKLFKKIKTKQQFLIKAQTQLFKVF。实验结果表明C‑P1显示出比母肽PZJ5更高的抗菌活性，并且没有溶血活性；采用扫描电镜和透射电镜研究了杂合肽C‑P1对大肠杆菌微观结构的影响，结果表明其抗菌机理与PZJ5相似，通过破坏细菌表面结构并导致内容物泄露，由于Cecropin A的N‑末端α‑螺旋片段与PZJ5的核心螺旋片段的协同作用，杂合肽C‑P1显示出优异的抗菌性质，其通过细胞表面和内部结构的破坏，从而导致细菌死亡。同时还观察到C‑P1与苍山籽精油对沙门氏菌显示出较强的协同作用。

A bacteriocin pzj5 hybrid peptide c-p1 and its application

【技术实现步骤摘要】
一种细菌素PZJ5杂合肽C-P1及其应用
本专利技术属食品科学和生物
，特别是一种食品防腐剂。
技术介绍
由化学防腐剂引起的食品安全风险是公众普遍关注的问题。一些抗微生物肽作为食品工业领域中的天然防腐剂逐渐引起关注。抗菌肽是一种短肽，其特征在于广谱的抗微生物活性。一些抗菌肽热稳定性好，对靶细胞无毒，同时能杀死微生物，可作为天然防腐剂的绝佳选择。从乳酸菌中分离提取的细菌素PZJ5是由22个氨基酸残基组成的α螺旋肽，对大部分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有较高的活性，无毒且具有良好的热稳定性。然而，它对一部分细胞的抗菌活性较低、在非酸性条件下无抑菌效果，这极大地限制了其在食品工业中的实际应用。本实验通过分子生物学和生物信息学方法对PZJ5进行肽序列的改造，获得抗菌活性更高、无细胞毒性且更适用于生产的新型杂合肽，使之能作为一种优良的天然防腐剂，更好地应用于食品工业。
技术实现思路
为了克服现有技术中的上述缺陷，本专利技术提供了一种细菌素PZJ5杂合肽C-P1，实验证明其具有优异的抗菌性质，可通过细胞表面和内部结构的破坏，从而导致细菌死亡。另外，C-P1对绵羊血细胞没有显示出溶血活性。本专利技术的新型杂合肽C-P1可作为食品防腐剂。本专利技术的第一个目的是提供一种细菌素PZJ5杂合肽C-P1，其特征在于：所述杂合肽的氨基酸序列为：VKWKLFKKIKTKQQFLIKAQTQLFKVF。杂合肽C-P1通过将CecropinA的具有两亲性的N端螺旋片段(1-8位氨基酸)与PZJ5的N-末端核心螺旋(1-18位氨基酸)连接并在杂合片段的N-末端添加缬氨酸(Val)以增加半衰期。对五种不同指示菌的抗菌活性实验表明，C-P1的抗菌活性显着高于亲本肽P的表达。C-P1的MIC范围为0.78至78.27μg/mL，而肽PZJ5的MIC范围为21至167μg/mL。当C-P1浓度为195.65μg/mL时的溶血率为0.43％，远低于50％。此时的浓度比C-P1的MIC高2.5-250倍。这些结果表明，杂合肽C-P1对红细胞的通透性几乎没有影响，具有较高的安全性。本专利技术的第二个目的是提供一种食品防腐剂，其特征在于：所述食品防腐剂包含细菌素PZJ5杂合肽，杂合肽的氨基酸序列为：VKWKLFKKIKTKQQFLIKAQTQLFKVF。进一步地，所述食品防腐剂还包括山苍籽精油。为进一步提高杂合肽的抗菌功效，C-P1与山苍籽精油组合进行协同作用的测试。结果表明，杂合肽C-P1与山苍籽精油对大肠杆菌的FIC指数为1，故具有叠加抑菌作用，对沙门氏菌的FIC指数为0.138，存在较强的协同抑菌作用。本专利技术以细菌素PZJ5为蓝本，通过连接不同抗菌肽片段，设计并合成了5种杂合肽(C-P1、C-P2、P-M1、P-M2、P-M3)，结果表明C-P1显示出比母肽PZJ5更高的抗菌活性，并且没有溶血活性；采用扫描电镜和透射电镜研究了杂合肽C-P1对大肠杆菌微观结构的影响，结果表明其抗菌机理与PZJ5相似，通过破坏细菌表面结构并导致内容物泄露，由于CecropinA的N-末端α-螺旋片段与PZJ5的核心螺旋片段的协同作用，杂合肽C-P1显示出优异的抗菌性质，其通过细胞表面和内部结构的破坏，从而导致细菌死亡。同时还观察到C-P1与苍山籽精油对沙门氏菌显示出较强的协同作用。附图说明图1：抗菌肽疏水性和亲水性残基在肽螺旋区域的分布示意图。其中灰色圆圈表示两亲性中的亲水区域，黑色圆圈表示两亲性中的疏水区域，白色圆圈表示两亲性中的其他区域。图2：扫描电镜与透射电镜图像，其中a：扫描电镜下未处理的大肠杆菌；b：扫描电镜下C-P在MIC下处理4h的大肠杆菌；c：扫描电镜下PZJ5-5在MIC下处理4h的大肠杆菌；d：透射电镜下未处理的大肠杆菌；e：透射电镜下C-P在MIC下处理4h的大肠杆菌；f：透射电镜下PZJ5-5在MIC下处理4h的大肠杆菌。图3：用C-P1处理的细菌荧光显微镜图像。A：光学显微镜下未处理的大肠杆菌；b：荧光显微镜下未处理的大肠杆菌；c：荧光显微镜下C-P在MIC下处理4h的大肠杆菌；d：光学显微镜下未处理的沙门氏菌；e：荧光显微镜下未处理的沙门氏菌；f：荧光显微镜下C-P在MIC下处理4h的沙门氏菌。图4：用PZJ5-5处理的细菌荧光显微镜图像。a：光学显微镜下未处理的铜绿假单胞菌；b：荧光显微镜下未处理的铜绿假单胞菌；c：荧光显微镜下PZJ5在MIC下处理4h铜绿假单胞菌；d：荧光显微镜下PZJ5-5在MIC下处理4h铜绿假单胞菌。具体实施方式材料菌株：大肠杆菌(Escherichiacoli)CGMCC1.12883，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CGMCC1.15148，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)CGMCC1.15424，沙门氏菌(Salmonellasp.)CGMCC1.755，单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)CGMCC1.10753均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。实施例1：新型肽的设计，合成和结构参数分析利用ProtParam软件在线计算和分析新型肽的主要结构参数(分子质量、等电点、正电荷数、不稳定系数、脂肪系数、GRAVY)。通过DSC方法预测多肽的螺旋结构，并利用ANTHEPRO蛋白质序列软件进行亲水性疏水性分析。设计的多肽由上海吉尔生化有限公司合成并纯化，将多肽溶解于适量蒸馏水，-20℃保存。本专利技术以PZJ5为蓝本设计了一系列杂合肽及突变衍生肽。C-P1是通过将CecropinA的具有两亲性的N端螺旋片段(1-8位氨基酸)与PZJ5的N-末端核心螺旋(1-18位氨基酸)连接并在杂合片段的N-末端添加缬氨酸(Val)以增加半衰期。与其相似，C-P2是将CecropinA1-8位氨基酸与PZJ53-18位氨基酸拼接杂合；P-M1是将PZJ53-18位氨基酸与Magainin21-12位氨基酸连接；P-M2是将PZJ51-18位氨基酸与Magainin21-12位氨基酸连接并在N-末端添加缬氨酸；P-M3是在P-M2基础上用缬氨酸替换第8位丝氨酸。PZJ5-1是PZJ5的16个残基组成的内肽段，保留了PZJ5的整个α螺旋区。截取PZJ5的N末端，并用赖氨酸取代2位的苏氨酸，得到PZJ5-2。为了提高多肽的两亲性，我们以PZJ5-1为基础设计了包含1-4个取代残基的类似物PZJ5-3、PZJ5-4、PZJ5-5和PZJ5-6。其中活性最高的PZJ5-5进行C末端酰胺化，得到PZJ5-7。抗菌肽的序列和理化性质如表1所示，疏水性和亲水性残基在肽螺旋区域的分布如图1所示。表1抗菌肽序列及理化性质实施例2：最低抑菌浓度(MIC)的测定和溶血活性测定通过微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(MinimalInhibitoryConcentrations，MIC)。将夜间培养的细菌细胞在相应液本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细菌素PZJ5杂合肽C-P1，其特征在于：所述杂合肽的氨基酸序列为：VKWKLFKKIKTKQQFLIKAQTQLFKVF。/n

【技术特征摘要】
1.一种细菌素PZJ5杂合肽C-P1，其特征在于：所述杂合肽的氨基酸序列为：VKWKLFKKIKTKQQFLIKAQTQLFKVF。


2.一种食品防腐剂，其特征在于：所述食品防腐剂包...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋达峰，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33