一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明专利技术将CAT基因与分子伴侣木聚糖酶XynA蛋白标签融合，合成XynA‑CAT抗菌肽融合基因；之后分别用限制性内切酶双酶切XynA‑CAT抗菌肽融合基因和表达载体pUC18质粒，连接，构建表达载体pUC18‑XynA‑CAT转化至大肠杆菌E.coli XL10‑Gold，获得重组大肠杆菌EXCT基因工程菌；然后通过培养EXCT菌株，表达获得Xyn A‑CAT抗菌肽融合蛋白；最后应用Factor Xa蛋白酶酶切，纯化，获得融合抗菌肽CAT。融合抗菌肽CAT具有良好的抑菌活性，为在生物医药、畜牧生产等产业的应用奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用。
技术介绍
抗菌肽(antimicrobialpeptides)是一类小分子多肽，是生物非特异性免疫防御系统的一个重要组成部分。第一个真正意义上的抗菌肽是1972年瑞典科学家GBoman等从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到的一种抑制细菌生长的多肽，并将其命名为天蚕素抗菌肽(Cecropin)。抗菌肽通常由10～50个氨基酸残基组成，N端一般具有近乎完美的双亲螺旋结构，多数多肽的C端乙酰化，其对抗菌肽的抗菌活性具有重要作用。天蚕素A(CecropinA)抗菌肽由37个氨基酸残基组成，分子质量大约为4kDa，不含半胱氨酸，无分子内二硫键的α螺旋肽。CecropinA抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较强的抑菌性能，如对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌效果较为明显。另外CecropinA抗菌肽具有抗病毒活性，对艾滋病病毒(HIV)的半抑制浓度(IC50)达到2-3μmol/L。同时它对肿瘤细胞也具有明显的抑制作用。另外，CecropinA抗菌肽还具有调节免疫，促中性粒细胞、T细胞的趋化以及促进伤口愈合等作用。因此CecropinA一直来受到很多科学家们的极高关注。死亡素(Thanatin)是抗菌谱最广的抗菌蛋白之一，由21个氨基酸残基组成。它不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌有良好的抑菌活性，而且对多种真菌也有良好的杀灭活性。其作用方式为阻断细胞膜上的呼吸链正常进行。一个Thanatin分子含2个Cys残基及由此形成的一个二硫桥，分子内有4个区域与良好的杀菌活性密切相关。目前，国内外在利用基因工程工具生物合成抗菌肽方面开展了大量的研发工作，应用比较广泛的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、昆虫杆状病毒载体表达系统、以及哺乳动物细胞表达体系等。昆虫病毒载体系统表达目的蛋白质，实验步骤繁琐，条件不易于控制，不适合大规模生产；酵母表达系统不仅培养密度低，抗菌肽的表达量有限，而且抗菌肽表达酰胺化不完全，影响其抗菌活性，同时酵母表达系统具有生产周期长，生产成本高的缺点；枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶比较容易降解目的蛋白，并且给纯化目的蛋白带来困难；昆虫杆状病毒载体表达系统和哺乳动物细胞表达体系同样存在表达量较低、不易产业化等不足。目前，细菌特别是大肠杆菌是以重组技术、工业规模生产蛋白质的主要宿主菌细胞。大肠杆菌具有诸多重要优点：基因组及遗传信息清楚，便于遗传操作并能保持工程菌株的稳定性；经短时间培养可获得高产率的产物；具有多种蛋白标签易于目的蛋白的纯化；培养细胞周期短且易于培养，生产成本低等优点。因此，提供一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种融合抗菌肽CAT的制备方法和应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种融合抗菌肽CAT的制备方法，具体步骤如下：(1)将天蚕素与死亡素的杂合抗菌肽基因CAT与分子伴侣木聚糖酶XynA蛋白标签融合，合成XynA-CAT抗菌肽融合基因；所述XynA-CAT抗菌肽融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；(2)用限制性内切酶EcoRI与PstI分别对XynA-CAT抗菌肽融合基因和表达载体pUC18进行双酶切，酶切后连接，构建表达载体pUC18-XynA-CAT；(3)将步骤(2)构建的表达载体pUC18-XynA-CAT转化至大肠杆菌E.coliXL10-Gold，获得重组大肠杆菌EXCT基因工程菌；(4)培养步骤(3)获得的重组大肠杆菌EXCT基因工程菌，获得XynA-CAT抗菌肽融合蛋白；对XynA-CAT抗菌肽融合蛋白进行分离纯化，获得纯化的XynA-CAT抗菌肽融合蛋白；(5)利用FactorXa蛋白酶切除XynA-CAT抗菌肽融合蛋白的XynA蛋白标签，经纯化获得融合抗菌肽CAT；所述融合抗菌肽CAT的的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步，步骤(1)采用固相亚磷酰胺三酯法合成XynA-CAT抗菌肽融合基因：在XynA对应核苷酸序列的N-末端添加亲和层析纯化标签6×His的核苷酸序列；在其C-末端连上FactorXa蛋白酶识别位点Ile-Asp-Gly-Arg和目的蛋白CAT的DNA序列，并在整个融合DNA序列的5’端和3’端分别加上EcoRI和PstI酶切位点及相应保护碱基。进一步，步骤(4)通过培养重组大肠杆菌EXCT基因工程菌获得XynA-CAT抗菌肽融合蛋白的具体步骤如下：将筛选的重组大肠杆菌EXCT基因工程菌单克隆，接种到加有氨苄青霉素的LB培养基中，在温度37℃、转速200rpm条件下振荡培养9～10小时；再按3％的比例转接到新鲜LB培养基中，在温度28℃、转速200rpm下培养至菌液OD595为0.7～0.9，用0.6mM的IPTG诱导后继续振荡培养9～11小时；低温离心收集菌体，加入裂解液，超声波破菌体后离心，取上清液，进行Ni-NTA亲和层析，再经洗涤、洗脱，获得纯化的XynA-CAT抗菌肽融合蛋白。进一步，所述超声条件如下：超声功率为300w，超声3s，停3s，共50～60个周期。所述的融合抗菌肽CAT在抑制细菌活性中的应用。进一步，所述细菌为大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌。基于抗菌肽的组成特点，仅由氨基酸残基组成，基本化学修饰翻译后加工很少，因而本专利技术采用原核表达系统进行表达。抗菌肽对大肠杆菌有较强的细胞毒性，且分子量较小不易直接表达，本专利技术借助融合蛋白来封闭抗菌肽的细胞毒性。同时，使用大肠杆菌生物合成活性蛋白质的另一个突出不足是目的产物在宿主胞浆内容易形成无生物活性的不溶性包涵体；为了克服大肠杆菌表达体系容易形成包涵体的缺点，本专利技术通过引入融合蛋白标签的方式表达外源蛋白。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术通过XynA标签蛋白与融合抗菌肽CAT基因融合，以借助XynA蛋白来封闭融合抗菌肽CAT的细胞毒性，使融合抗菌肽的毒性减弱；(2)本专利技术通过与分子伴侣木聚糖酶XynA蛋白标签融合，由于XynA具有较高的水溶性，增强了其所融合的目的蛋白CAT的在后处理工艺中的可溶性。(3)本专利技术以木聚糖酶XynA以及FactorXa蛋白酶的酶切位点的氨基酸序列作为融合标签，可以使FactorXa蛋白酶准确无误地切除融合标签，产生具有天然N端的目标蛋白CAT；通过Ni-NTA柱亲和层析、SephadexG-25脱盐以及FactorXa蛋白酶酶切等处理，最终获得蛋白CAT的纯度超过95％；(4)本专利技术的表达系统构建方便易行，成本经济，为应用于医药、兽药、水产、饲料添加剂等产业替代抗生素奠定了一定的基础。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合抗菌肽CAT的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：/n(1)将天蚕素与死亡素的杂合抗菌肽基因CAT与分子伴侣木聚糖酶XynA蛋白标签融合，合成XynA-CAT抗菌肽融合基因；所述XynA-CAT抗菌肽融合基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；/n(2)用限制性内切酶EcoRI与PstI分别对XynA-CAT抗菌肽融合基因和表达载体pUC18进行双酶切，酶切后连接，构建表达载体pUC18-XynA-CAT；/n(3)将步骤(2)构建的表达载体pUC18-XynA-CAT转化至大肠杆菌E.coliXL10-Gold，获得重组大肠杆菌EXCT基因工程菌；/n(4)培养步骤(3)获得的重组大肠杆菌EXCT基因工程菌，获得XynA-CAT抗菌肽融合蛋白；对XynA-CAT抗菌肽融合蛋白进行分离纯化，获得纯化的XynA-CAT抗菌肽融合蛋白；/n(5)利用FactorXa蛋白酶切除XynA-CAT抗菌肽融合蛋白的XynA蛋白标签，经纯化获得融合抗菌肽CAT；所述融合抗菌肽CAT的的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合抗菌肽CAT的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将天蚕素与死亡素的杂合抗菌肽基因CAT与分子伴侣木聚糖酶XynA蛋白标签融合，合成XynA-CAT抗菌肽融合基因；所述XynA-CAT抗菌肽融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
(2)用限制性内切酶EcoRI与PstI分别对XynA-CAT抗菌肽融合基因和表达载体pUC18进行双酶切，酶切后连接，构建表达载体pUC18-XynA-CAT；
(3)将步骤(2)构建的表达载体pUC18-XynA-CAT转化至大肠杆菌E.coliXL10-Gold，获得重组大肠杆菌EXCT基因工程菌；
(4)培养步骤(3)获得的重组大肠杆菌EXCT基因工程菌，获得XynA-CAT抗菌肽融合蛋白；对XynA-CAT抗菌肽融合蛋白进行分离纯化，获得纯化的XynA-CAT抗菌肽融合蛋白；
(5)利用FactorXa蛋白酶切除XynA-CAT抗菌肽融合蛋白的XynA蛋白标签，经纯化获得融合抗菌肽CAT；所述融合抗菌肽CAT的的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。


2.根据权利要求1所述的一种融合抗菌肽CAT的制备方法，其特征在于，步骤(1)采用固相亚磷酰胺三酯法合成XynA-CAT抗菌肽融合基因：在XynA对应核苷酸序列的N-末端添加亲和层析纯化标签6×His的核苷酸序列；在其C-末端连上Factor...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭抗抗，刘勇，姬生跃，张彦明，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61