靶向NKG2D的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体，其氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向NKG2D的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明专利技术还提供了一种包括靶向NKG2D的的嵌合抗原受体的CAR‑T细胞及其制备，以及它们在制备预防、诊断、治疗肝癌、宫颈癌和胰腺癌等恶性肿瘤中的应用。

Chimeric antigen receptor and chimeric antigen receptor T cells targeting NKG2D and their preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
靶向NKG2D的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。
技术介绍
CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)技术是一种新型免疫细胞疗法，它是将经过CAR改造的T细胞回输至人体，激活人体自身免疫系统，持续性对靶向肿瘤细胞进行杀伤，被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一。NKG2D是一种凝集素样的II型跨膜糖蛋白，其在NK细胞、CD8+T细胞、活化的巨噬细胞和肿瘤浸润的γδT细胞表面均有表达，且NKG2D配体的表达是细胞处于“应激状态”的一个指标，例如当细胞受到病毒感染和恶性转化时，但很少会出现在健康细胞的表面。而NKG2D配体几乎在人体所有组织来源的肿瘤细胞上有不同程度的表达，例如肝癌、卵巢癌、胰腺癌等。尽管NKG2D配体为肿瘤的免疫治疗提供了一个更为精确的靶点，但目前靶向NKG2D的CAR-T细胞的研究较少，且在实际应用中不能长效持久地发挥高杀伤肿瘤细胞的能力。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T细胞及其制备、包含靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因的重组载体，以及它们在预防、诊断和治疗具有NKG2D配体的恶性肿瘤中的应用。具体地，第一方面，本专利技术提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体CAR-NKG2D，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向NKG2D的的单链抗体包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向NKG2D的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。其中，所述靶向NKG2D的单链抗体为人源化单链抗体，可以避免引起人机体的免疫反应，具有较高的安全性。可选地，所述靶向NKG2D的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：5所示的核苷酸序列。本专利技术中，所述胞外铰链区用于促进所述靶向NKG2D的单链抗体与肿瘤上的表达的FGFR4结合。可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。本专利技术中，所述跨膜区用于固定所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体CAR-NKG2D。可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。本专利技术中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。可选地，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。在本专利技术一实施方式中，所述胞外铰链区为CD8α铰链区；所述跨膜区为CD8跨膜区；所述胞内信号区包括从氨基端到羧基端顺次连接的4-1BB信号区和CD3ζ信号区。即，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的氨基酸序列。可选地，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。进一步可选地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。进一步地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向NKG2D的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因。其中，所述靶向NKG2D的单链抗体的编码基因包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列。可选地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括如SEQIDNO：4所示的核苷酸序列。与SEQIDNO：3所示的核苷酸序列相比，SEQIDNO：4所示的核苷酸序列中多了信号肽的编码基因。其中，所述信号肽的编码基因可较好地指导所述CAR-NKG2D表达到细胞表面，但在嵌合抗原受体CAR-NKG2D表达到T细胞表面时，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的CAR-NKG2D的氨基酸序列(SEQIDNO：2)中并未带有信号肽的氨基酸序列。可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。可选地，所述信号肽的编码基因包括如SEQIDNO：7所示的核苷酸序列。本专利技术第一方面提供的所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体CAR-NKG2D可以专一性地靶向表达NKG2D配体的肿瘤细胞，在CAR-NKG2D与NKG2D配体结合后，可以使T细胞的胞内信号区被激活，促进T细胞在患者体内的扩增，并高效且特异性地杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎不会造成损伤，且能够持久地维持其自我更新能力和肿瘤杀伤力。第二方面，本专利技术提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞，包括第一方面所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体。本专利技术第二方面提供的靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞可以专一性地靶向表达NKG2D的肿瘤细胞，在CAR-FGFR4与FGFR4结合后，该CAR-T细胞的胞内信号区被激活，促进其在患者体内的扩增，长效持久地发挥高效且特异性杀伤肿瘤细胞的能力，而对正常细胞几乎不会造成损伤。第三方面，本专利技术提供了一种重组载体，所述重组载体包括如第一方面所述的靶向FGFR4的嵌合抗原受体CAR-NKG2D的编码基因。可选地，所述重组载体中的所述载体为病毒载体和非病毒载体中的至少一种。其中，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。优选为慢病毒载体，例如pWPXLD载体、pLEX-MCS载体、pSico载体和pCgpV载体中的至少一个，但不限于此。其中，所述非病毒载体包括质粒载体和噬菌体载体。具体地，所述质粒载体可以但不限于为真核质粒载体、原核质粒载体、微环DNA、转座子等。当所述载体为微环DNA时，可以将插入靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因的重组微环DNA直接转染CD3阳性T淋巴细胞，制得靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞。本专利技术第三方面提供的重组载体安全高效，可以稳定高效地将CAR-NKG2D的编码基因导入宿主细胞中或复制，并可以用于制备靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞，使所述T细胞持续、稳定地发挥靶向、杀伤效力。第四方面，本专利技术提供了一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括：(1)提供靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向NKG2D的单链抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向NKG2D的的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向NKG2D的的单链抗体包括如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。


2.如权利要求1所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的氨基酸序列包括如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。


3.如权利要求1所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因包括如SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。


4.一种靶向NKG2D嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，其表面表达如权利要求1-3任一项所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体。


5.一种重组载体，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因。


6.一种靶向NKG2D的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括：
(1)提供靶向NKG2D的嵌合抗原受体的编码基因，包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向NKG2D的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘茂玄，许晨光，黎琴子，
申请(专利权)人：深圳宾德生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44