一种流感、HIV嵌合蛋白及嵌合病毒疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种流感、HIV嵌合蛋白及流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗的制备方法，具体步骤包括以下：利用活的流感病毒来进一步感染可以稳定表达融合蛋白(gp120‑HA2)的哺乳动物细胞系，最终获得能够在病毒囊膜上定向展示gp120‑HA2融合蛋白的流感、艾滋(HIV)嵌合病毒，用作灭活疫苗，以同时抵抗流感病毒和艾滋病毒对机体的侵染。

【技术实现步骤摘要】
一种流感、HIV嵌合蛋白及嵌合病毒疫苗的制备方法
本专利技术涉及一种流感、HIV嵌合病毒疫苗的制备方法以及(gp120-HA2)融合蛋白的设计，属于一种新型的嵌合疫苗，属于疫苗生产

技术介绍
流感病毒的传播和不断变异严重威胁到国家的公共卫生安全。尤其是最近几年，禽流感病毒的不断变异以及在人群中的爆发，导致了极高的死亡率，禽流感病毒可能会在未来进一步地获得人与人之间传播与扩散的能力，这将成为了未来人类社会的最大可能的威胁。目前我国大多数流感疫苗生产厂家还是以鸡胚为主要的繁殖病毒的基质。该工艺对健康、无菌的鸡胚存在很大的依赖性，鸡胚的供应量可能无法满足大规模疫情爆发时所需要的生产条件，进而可能导致流感病毒疫苗的产量不足，无法保障能快速地为全社会提供充足的疫苗供给。因此，开发出以哺乳动物细胞发酵为基础的疫苗生产体系，能够极大地弥补鸡胚供应不足的限制，有效地提高了流感疫苗生产的产量。为了能够利用细胞发酵技术以工业化生产优质的流感疫苗，研究人员研发并采用优化的微载体细胞悬浮培养、无血清培养、优化细胞培养密度或工程化改造细胞系等方法，以进一步地提高基于细胞培养的流感疫苗产量。流感病毒血凝素HA蛋白，由球状区HA1结构域和茎部区HA2结构域组成，HA1约有320个氨基酸,由一些不平行的折叠构成球状头部；HA2约有240个氨基酸,和部分HA1区一同组成茎部三聚体区域,含有多股螺旋结构,其C端含有细胞膜锚定序列以及膜融合多肽等功能单位。人类免疫缺陷病毒(HIV)目前仍在全球大规模的传播，并每年导致大量感染者的死亡与发病，艾滋病人已经成为了各个国家沉重的负担，每年投入在艾滋病预防、治疗的经费，仍然不断增加。然而，艾滋病的治疗甚至艾滋病疫苗仍然还是处于研发阶段。虽然疫苗被认为是预防病毒性传染病的最有效的武器。不幸的是，HIV属于逆转录病毒，极容易产生突变，能够发生快速的抗原转变并形成不同血清型的各种复杂毒株。如何生产出针对各种血清型的HIV毒株都具有交叉保护效果的HIV疫苗，已经成为了疫苗研发领域中的最严峻的挑战。传统的制备化学灭活以及减毒疫苗的生产方法已经被证明无法生产出具备广谱保护效力的HIV-1疫苗。使用新的疫苗抗原展示平台，开发出有效的HIV疫苗，是未来重要的研究方向之一。基于以上背景，生产出能够同时抵抗流感病毒与艾滋病毒的新型疫苗载体具有良好的市场发展潜力。
技术实现思路
本专利技术的主要目的，在于制备能够在流感病毒囊膜上定向展示gp120-HA2融合蛋白的流感、艾滋(HIV)嵌合病毒，用作灭活疫苗，以同时抵抗流感病毒和艾滋病毒对机体的侵染。本专利技术的另一目的，在于提供gp120-HA2融合蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提供所述的gp120-HA2融合蛋白在制备流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗中的用途。本专利技术所述的流感、HIV嵌合蛋白(gp120-HA2融合蛋白)是由流感病毒血凝素蛋白(HA蛋白)的HA2区结构域与HIV病毒囊膜蛋白gp120相融合而得到的。血凝素蛋白的HA2区结构域可以保证融合蛋白(gp120-HA2)自发地嵌入到流感病毒的囊膜上，并形成三聚体结构，从而以三聚体的形式正确展示HIV的gp120蛋白。该融合蛋白(gp120-HA2)属于一型跨膜蛋白，从N端到C端分别由流感病毒HA蛋白的信号肽、HIV的囊膜蛋白gp120、流感病毒HA蛋白的HA2区构成。此外HA2结构域还包含了流感HA蛋白的跨膜区(TMD)以及和胞质区(CPD)。gp120-HA2的具体结构如实施例中的图1的样本。此融合蛋白的序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术公开一种流感、HIV嵌合病毒，此新型嵌合病毒能够在天然流感病毒的囊膜上进一步地展示gp120-HA2融合蛋白，该融合蛋白是通过流感病毒HA2的跨膜区和胞质尾，从而特异性地嵌入到病毒囊膜的磷脂双分子层膜中，并且可以自发地形成三聚体的gp120-HA2膜蛋白，将gp120展示在天然流感病毒的外表面，最终获得高滴度的流感、HIV嵌合病毒。本专利技术公开一种流感、HIV嵌合病毒疫苗的制备方法，其制备过程包括以下三个步骤：S1:使用携带外源基因质粒(PLV-gp120-HA2)慢病毒感染哺乳动物细胞系，在一定浓度的嘌呤霉素的筛选下，获得可以在细胞质膜上稳定地表达流感、艾滋(HIV)囊膜融合蛋白(gp120-HA2)的细胞株；S2:将活的流感病毒接种在此基因工程改造的稳转细胞株，并加入TPCK-胰酶培养48至72h，利用流感病毒从细胞质膜出芽的机理，最终使得重组的囊膜融合蛋白(gp120-HA2)展示在该流感病毒的囊膜上，从而获得高滴度的流感HIV嵌合病毒；S3:超速离心获得流感HIV嵌合病毒，并灭活该嵌合病毒，用作能够同时抵抗流感病毒以及艾滋病毒的双价疫苗。本专利技术嵌合病毒的灭活操作可以使用去氧胆酸钠、Triton-X100或吐温80等化学表面活化剂，对嵌合病毒进行裂解作用；或直接向此嵌合病毒悬液加入甲醛溶液对嵌合病毒进行灭活处理，处理后的病毒可以通过透析、过滤或者离心的方式进一步被分离纯化。本专利技术涉及到一种在流感、HIV嵌合病毒的制备过程中所使用的稳定表达细胞株，该哺乳动物细胞株不仅可以用于流感病毒的繁殖和大规模工业化生产，而且还能够定向表达gp120-HA2融合蛋白到哺乳动物细胞的质膜上。通过构建可以稳定地表达流感、艾滋(HIV)囊膜融合蛋白(gp120-HA2)的细胞株，再利用活的流感病毒对此稳转细胞系的感染，当流感病毒从细胞质膜出芽的过程中，最终使得重组表达的囊膜融合蛋白(gp120-HA2)嵌入在该流感病毒的囊膜上，从而产生可以展示gp120-HA2膜蛋白的嵌合病毒。该基因工程改造后的哺乳动物细胞系包括常用的流感病毒生产细胞系，如VERO细胞、MDCK细胞、CHO细胞以及HEK293T细胞系等。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步说明。图1为gp120-HA融合蛋白的结构设计示意图；图2为稳转MDCK细胞株的免疫荧光实验；图3嵌合病毒中的GP120的WB检测；图4为小鼠抗血清对H1N1流感病毒的中和实验；图5为小鼠抗血清对HIV的中和实验。具体实施方式本专利技术一种流感、HIV嵌合病毒灭活疫苗的制备方法包括以下具体步骤：(1)流感病毒在哺乳动物细胞中的体外培养与保存：先把欲培养病毒标本用PBS缓冲液稀释到合适浓度后,加入抗生素,然后用移液器将流感H1N1病毒接种入含有细胞液的细胞,放置37℃培养48-72h后,收集上清并4000rpm/min离心5min后，再将上清液转移到新的离心管中，分装后并放置于负80℃的冰箱中保存。哺乳动物细胞一般选择常用的流感病毒生产细胞系，如VERO细胞、MDCK细胞、CHO细胞。(2)携带外源基因质粒(PLV-gp120-HA2)的慢病毒的包装：质粒转染前，将HEK293T细胞接种到一个直径10cm的细胞培养皿中，接种细胞数量应以转染当天的细胞生长达到90本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.gp120-HA2融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.gp120-HA2融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.如权利要求1所述的gp120-HA2融合蛋白在制备流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗中的用途。


3.编码权利要求1所述的gp120-HA2融合蛋白的碱基序列,其碱基序列如SEQIDNO：2所示。


4.流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：利用活的流感病毒来进一步感染可以稳定表达权利要求1所述的融合蛋白gp120-HA2的哺乳动物细胞系，最终获得能够在病毒囊膜上展示gp120-HA2融合蛋白的流感、艾滋HIV嵌合病毒，作用灭活疫苗，以同时抵抗流感病毒和艾滋病毒对机体的侵染，方法包括以下三个步骤：
S1:使用携带外源基因质粒PLV-gp120-HA2慢病毒感染哺乳动物细胞系，在一定浓度的嘌呤霉素的筛选下，获得可以在细胞质膜上稳定地表达流感、艾滋HIV囊膜融合蛋白gp120-HA2的细胞株；
S2:将活的流感病毒接种在此基因工程改造的稳转细胞株，并加入TPCK-胰酶培养48至72h，利用流感病毒从细胞质膜出芽，最终使得重组的囊膜融合蛋白gp120-HA2展示在该流感病毒的囊膜上，从而获得高滴度的流感HIV嵌合病毒；
S3:超速离心获得流感HIV嵌合病毒，并灭活该嵌合病毒，用作能够同时抵抗流感病毒以及艾滋病毒的双价疫苗。


5.根据权利要求4所述的一种流感、艾滋嵌合病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘刚，张鹏飞，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35