一种融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，特别涉及一种融合蛋白及其应用。该融合蛋白将质膜定位序列、Dab1蛋白与光敏蛋白及荧光蛋白融合，定位到细胞质膜的脂筏或者非脂筏区域，通过光照可局部地、高时空分辨率地实现PI3K/Akt信号通路的快速激活与调控。对该信号通路快速、有效以及特异性的开关控制，有助于了解信号的级联传递规律，对于研究与该信号通路密切相关的疾病具有十分重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白及其应用
本专利技术涉生物医药
，尤其涉及一种融合蛋白及其应用。
技术介绍
磷脂酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide3-kinases,PI3K)是一种胞内磷脂酰肌醇激酶接受来自酪氨酸激酶和G蛋白偶联受体的信号后，在质膜处将底物小分子PtdIns(4，5)P2催化形成PtdIns(3，4，5)P3(以下简称PI3P)。PI3P激活Akt等下游蛋白。该信号通路广泛存在与各种细胞，是细胞内重要的促生存信号通路，调节细胞增殖、分化、生长、存活、代谢和迁移等多种活性。研究表明，PI3K/Akt通路异常与人类肿瘤、神经退行性疾病、胰岛素抵抗相关疾病如II型糖尿病、心脑血管疾病等的发生、发展密切相关。通过对该信号通路的快速、有效以及特异性的开关控制，有助于了解信号的级联传递规律，对于研究与该信号通路密切相关的疾病具有十分重要的意义。传统方法采用化学物质(如IGF-1)激活PI3K/Akt通路用于研究正常细胞、肿瘤细胞的迁移和细胞形态变化等，该方法时空分辨率较低，且诱导方法比较复杂。光遗传学作为一门新兴的学科在以神经科学为主的很多领域被广泛应用，光遗传学技术结合蛋白的遗传学表达与激光的光控和成像，可实现细胞内特定信号通路分子的快速激活与调控。目前已经实现了对PI3K/Akt通路的光学调控，如Idevall-HagrenO等人采用光控工具来控制PI3K在质膜处的产生，见图1。该方法将PI3K的催化亚基p110α利用光控蛋白作用对CIBN/Cry2将其拉到质膜附近，从而催化PI3P的形成。该方法比传统化学小分子诱导方法简便，时空分辨率较高，但是需要在细胞中需要表达2个融合蛋白，即CIBN-CAAX和mCh-CRY2-iSH2达到最佳效果所需的每种蛋白的表达量需要耗费大量时间精力去摸索，而且iSH2是来源于PI3K亚基，过多表达可能对诱导结果产生影响，不利于PI3K/Akt通路的控制。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种融合蛋白及其应用。本专利技术提供的融合蛋白可快速有效、高时空分辨率地局部激活PI3K/Akt信号通路。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供了一种融合蛋白，包括质膜定位序列、Dab1蛋白、光敏蛋白和荧光蛋白；所述质膜定位序列为lyn蛋白定位序列或KRas蛋白定位序列。在一些实施方案中，所述lyn蛋白定位序列为：(1)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；或(2)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸残基获得具有同等功能的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述KRas蛋白定位序列为：(1)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列；或(2)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸残基获得具有同等功能的氨基酸序列。在一些具体实施例中，所述光敏蛋白为隐花色素Cry2olig蛋白。在一些具体实施例中，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白mCherry或黄色荧光蛋白mCit。在一些实施方案中，所述融合蛋白具有如SEQIDNO:3～5所示的氨基酸序列或在SEQIDNO:3～5所示的氨基酸序列中取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸获得的具有同等功能的氨基酸序列。在一个具体实施例中，所述融合蛋白具有如SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。该融合蛋白由lyn蛋白定位序列、Dab1蛋白、隐花色素Cry2olig蛋白和红色荧光蛋白mCherry组成，即lyn-Dab1-Cry2olig-mCh。在一个具体实施例中，所述融合蛋白具有如SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。该融合蛋白由lyn蛋白定位序列、Dab1蛋白、隐花色素Cry2olig蛋白和黄色荧光蛋白mCit组成，即lyn-Dab1-Cry2olig-mCit。在一个具体实施例中，所述融合蛋白具有如SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。该融合蛋白由Dab1蛋白、隐花色素Cry2olig蛋白、黄色荧光蛋白mCit和KRas蛋白定位序列组成，即Dab1-Cry2olig-mCit-KRas。本专利技术还提供了编码本专利技术所述融合蛋白的DNA分子。在一些实施方案中，本专利技术提供了编码具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNO.6。在一些实施方案中，本专利技术提供了编码具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNO.7。在一些实施方案中，本专利技术提供了编码具有SEQIDNO:5所示的氨基酸序列的DNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNO.8。由于密码子的简并性，除了SEQIDNO.6～8所示的核苷酸序列，还可以存在很多种能够编码本专利技术所述的融合蛋白的DNA分子。本专利技术还提供了一种重组DNA载体，包含本专利技术所述DNA分子。重组DNA载体是一种表达载体，本领域技术人员将所述融合蛋白的DNA分子克隆到表达载体中，转化宿主细胞，通过诱导表达获得融合蛋白。所述表达载体包括pCAG系列载体。在一些实施方案中，所述表达载体为pCAG系列中的pCAG-DsRed2。本专利技术还提供了一种宿主细胞，包含本专利技术所述重组DNA载体。进一步地，本专利技术还提供了所述融合蛋白在制备PI3K信号通路激活剂中的应用。所述与PI3K/Akt信号通路相关的疾病包括神经退行性疾病、心脑血管疾病和糖尿病研究表明，本专利技术提供的融合蛋白可以分别定位于质膜lipidraft(脂筏)/non-lipidraft(非脂筏)区域的lyn-opto-Dab1/opto-Dab1-KRas，可以更加精细的研究性质不同的质膜区域中PI3K激酶活化的效果。经研究发现本专利技术融合有特定质膜定位序列的lyn-opto-Dab1/opto-Dab1-KRas蛋白，与opto-Dab1融合蛋白相比，仅有质膜上的扩散过程，不含胞浆快速扩散的过程，空间分辨率更高。本专利技术提供的融合蛋白将lyn的质膜定位序列、Dab1蛋白与光敏蛋白及荧光蛋白融合，通过光照可局部地、高时空分辨率地实现PI3K/Akt信号通路的快速激活与调控。对该信号通路快速、有效以及特异性的开关控制，有助于了解信号的级联传递规律，对于研究与该信号通路密切相关的疾病具有十分重要的意义。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为现有技术光控激活PI3K通路的结构示意图；图2为本专利技术融合蛋白lyn-Dab1-Cry2olig-mCh结构示意图；图3为融合蛋白lyn-Dab1-cry2olig-mCit与Akt-PH-mCh共同转染COS7细胞细胞的荧光分析图；图4为融合蛋白Dab1-Cry2olig-mCit-KRas与Akt-PH-mCh共同转染COS7细胞细胞的荧光分析图；图5为融合蛋白lyn-opto-Dab1-mCh在COS7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，包括质膜定位序列、Dab1蛋白、光敏蛋白和荧光蛋白；/n所述质膜定位序列为lyn蛋白定位序列或KRas蛋白定位序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，包括质膜定位序列、Dab1蛋白、光敏蛋白和荧光蛋白；
所述质膜定位序列为lyn蛋白定位序列或KRas蛋白定位序列。


2.根据权利要求1所述的融合蛋白，所述lyn蛋白定位序列为：
(1)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；
或(2)SEQIDNO：1所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸残基获得具有同等功能的氨基酸序列；
所述KRas蛋白定位序列为：
(1)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列；
或(2)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸残基获得具有同等功能的氨基酸序列。


3.根据权利要求1所述融合蛋白，所述光敏蛋白为隐花色素Cry2olig蛋白。


4.根据权利要求1所述融合蛋白，所述荧光蛋白为红色荧光蛋白mCherry或黄色荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：储军，王亮，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44