针对中东呼吸综合征冠状病毒的抗体-多肽双特异性免疫治疗剂制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及抗体与抗病毒多肽的融合蛋白，具体涉及针对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS‑CoV)的全人源中和抗体、高活性MERS‑CoV抑制多肽的双特异性高效免疫治疗剂，及其应用。本发明专利技术的抗体‑多肽双特异性免疫治疗剂是一种抗体与抗病毒多肽的融合蛋白，其中抗体为高活性MERS‑CoV全人源中和抗体，多肽为高活性MERS‑CoV抑制多肽。该双特异性免疫治疗剂同时具有抗体与多肽的抗病毒活性，可进一步制备一类强效抗病毒药物，尤其适用于治疗中东呼吸综合征冠状病毒(MERS‑CoV)疾患。

【技术实现步骤摘要】
针对中东呼吸综合征冠状病毒的抗体-多肽双特异性免疫治疗剂
本专利技术属于生物
，涉及抗体与抗病毒多肽的融合蛋白，具体涉及针对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的全人源中和抗体、高活性MERS-CoV抑制多肽的双特异性高效免疫治疗剂，及其应用。
技术介绍
中东呼吸综合征冠状病毒(MiddleEastRespiratorySyndromeCoronavirus，MERS-CoV)是2012年6月由病毒学家AliM.Zaki发现的一种新型冠状病毒[1]。MERS感染患者在临床上表现出与SARS非常相似的症状，多会出现严重的呼吸系统综合征，并伴有较高比率的急性肾衰竭，其致死率目前约36％，远高于SARS流行期间约10％的致死率[2,3]。2012年起至今MERS已波及26个国家，其中2015年在韩国爆发的疫情发展十分迅速，对世界公共健康造成了重大且持续的威胁。目前国际上尚无针对MERS-CoV的疫苗或特效药物，因此开发出有效的抗病毒治疗和预防药品迫在眉睫。研究表明，单克隆抗体药物以其高特异性、有效性和安全性已经发展为生物医药的最重要组成部分之一，在多个种类重大疾病的治疗领域都有广泛的应用。在SARS爆发期间，针对SARS-CoV的单克隆抗体已被证明在体外及动物模型中具有极好的抗病毒效果，说明单克隆抗体具有作为冠状病毒防治药物的巨大潜力。与SARS类似，研究人员在MERS病人或者康复患者的血清内检测到了高水平的抗MERS-CoV的抗体[4,5]。有报道，从噬菌体展示的超大型全人源抗体库中筛选到一系列具有与病毒蛋白极高亲和力的抗体，其中单抗m336与MERS-CoV表面S蛋白受体结合区(ReceptorBindingDomain,RBD)的结合亲和力常数达到99pM，并发现m336针对MERS-CoV假病毒的中和活性(IC50)达到0.005g/ml，针对MERS-CoV活病毒的中和活性达到0.07g/ml，系目前国际上已报道的活性最强的抗MERS-CoV抗体之一[6]。进一步的动物实验证明m336抗体在狨猴、兔子和转基因小鼠模型中效果显著，说明单抗m336有望用于临床，作为挽救病人生命的特效候选药物。同时，除了单克隆抗体药物外，一系列多肽类病毒融合抑制剂也是目前抗病毒药物研究的热点之一。这类多肽衍生于病毒本身的包膜蛋白，可以与病毒的包膜蛋白结合，从而阻止病毒与宿主细胞融合所必需的活性六螺旋结构的形成，达到阻止病毒入侵的目的。有研究发现了一种衍生于MERS-CoVS2蛋白的多肽HR2P，能够与S2蛋白的HR1区(HeptadRepeat1Domain)相互作用，并产生螺旋状的6-HB复合物，具有竞争病毒S2蛋白形成6-HB的能力，从而抑制病毒复制。进一步发现，HR2P能够有效抑制S蛋白介导的细胞与细胞融合以及MERS-CoV对Vero细胞的感染[7,8]。HR2P多肽正在被进一步优化并改善其抑制活性，这些HR2P类似物也很有可能进一步发展为有效预防或治疗MERS-CoV的病毒融合抑制剂。然而，多肽药物需要化学合成，存在着代谢不稳定、体内半衰期短、生物利用度低及靶向性不够强等缺点，严重阻碍了多肽药物在临床治疗中的广泛应用。另一方面，单克隆抗体药物分子量过大(150kDa)，从而导致其在临床应用时存在组织渗透性较差、难以达到一些具有空间位阻的靶点，及生产成本高、价格昂贵的缺点，使得单克隆抗体药物虽在癌症、免疫性疾病治疗领域获得巨大成功，但在抗病毒治疗等领域的应用还相对有限。此外，单克隆抗体作用靶点单一，有可能会引起病毒的逃逸。因此，探索一种新的免疫治疗剂，使其能兼具抗体与多肽类药物的优势且弥补它们的缺陷，意义重大。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供新的针对中东呼吸综合征冠状病毒的抗体-多肽双特异性免疫治疗剂.与本专利技术相关的现有技术有：[1]A.M.Zaki,S.vanBoheemen,T.M.Bestebroer,A.D.Osterhaus,R.A.Fouchier,IsolationofanovelcoronavirusfromamanwithpneumoniainSaudiArabia,TheNewEnglandjournalofmedicine,367(2012)1814-1820.[2]J.F.Chan,S.K.Lau,K.K.To,V.C.Cheng,P.C.Woo,K.Y.Yuen,MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus:anotherzoonoticbetacoronaviruscausingSARS-likedisease,Clinicalmicrobiologyreviews,28(2015)465-522.[3]J.F.Chan,K.S.Li,K.K.To,V.C.Cheng,H.Chen,K.Y.Yuen,Isthediscoveryofthenovelhumanbetacoronavirus2cEMC/2012(HCoV-EMC)thebeginningofanotherSARS-likepandemic？,TheJournalofinfection,65(2012)477-489.[4]U.Buchholz,M.A.Muller,A.Nitsche,A.Sanewski,N.Wevering,T.Bauer-Balci,F.Bonin,C.Drosten,B.Schweiger,T.Wolff,D.Muth,B.Meyer,S.Buda,G.Krause,L.Schaade,W.Haas,ContactinvestigationofacaseofhumannovelcoronavirusinfectiontreatedinaGermanhospital,October-November2012,Eurosurveillance:bulletinEuropeensurlesmaladiestransmissibles＝Europeancommunicablediseasebulletin,18(2013).[5]D.S.Hui,M.Peiris,MiddleEastRespiratorySyndrome,Americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine,(2015).[6]T.Ying,L.Du,T.W.Ju,P.Prabakaran,C.C.Lau,L.Lu,Q.Liu,L.Wang,Y.Feng,Y.Wang,B.J.Zheng,K.Y.Yuen,S.Jiang,D.S.Dimitrov,ExceptionallypotentneutralizationofMiddleEastrespiratorysyndromecoronavirusbyhumanmonoclonalantibodies,Journalofvirology,88(2014)7796-7805.[7]L.Lu,Q.Liu,Y.Zhu,K.H.Chan,L本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白由m336抗体的单链可变片段scFv通过一个连接肽(Gly4Ser)3与抗病毒多肽HR2P相连构成，其中，所述的m336抗体scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述的HR2P的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白由m336抗体的单链可变片段scFv通过一个连接肽(Gly4Ser)3与抗病毒多肽HR2P相连构成，其中，所述的m336抗体scFv的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，所述的HR2P的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。


2.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白由m336抗体的单链二聚体diabody通过一个连接肽(Gly4Ser)3与抗病毒多肽HR2P相连构成，其中，所述的m336抗体diabody的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。


3.如权利要求1-2中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，其中的m336抗体片段是全人源的。


4.如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，其中的m336单链抗体为IgG。


5.如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述的抗原结合片段是scFv,Fv,Fab或F(ab)2。


6.一种双特异性抗体，其特征在于，含有权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段。


7.如权利要求1-5任一项所述的融合蛋白或权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体或抗原结合片段，或所述的双特异性抗体，与一种效应分子偶联。


8.权利要求7所述的融合蛋白或所述的双特异性抗体，其特征在于，所述的偶联物中的效应分子是可检测标记，选自荧光标记，放射性标记，亲和素，生物素，或酶；或绿脓杆菌外毒素或化疗剂。


9.一种核酸分子，其编码权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或抗原结合片段，权利要求6所述的双特异性抗体，或权利要求7-8中任一项所述的偶联物。


10.如权利要求9所述的核酸分子，其特征在于，可操作地连接至启动子。


11.一种质...

【专利技术属性】
技术研发人员：应天雷，王丽丽，吴艳玲，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31