本发明专利技术属于分子生物学和肿瘤学领域，具体公开了肿瘤相关抗原RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备食管癌检测试剂盒中的应用，尤其是将其应用于制备早期筛查食管癌检测试剂盒中，极大地提高了临床食管癌的检测效率和诊断效率，有利于在普通实验室广泛推广使用。将这8种蛋白应用于ELISA试剂盒可同时检测血清样品中8种TAA抗体的表达水平，检出成功率高，技术重现性好。对应地，能够特异性检测RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1组合的表达水平的分子，也可以作为食管癌检测试试剂，应用于食管癌检测试剂盒中，同样具有较高特异性和敏感性。
Application of esophageal cancer associated antigen protein combination or its specific antibody in esophageal cancer detection kit
【技术实现步骤摘要】
食管癌相关抗原蛋白组合或其特异性抗体在食管癌检测试剂盒中的应用
本专利技术属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及食管癌相关抗原蛋白组合或其特异性抗体在食管癌检测试剂盒中的应用。
技术介绍
食管癌(esophagealcancer,EC)是起源于食管粘膜上皮的恶性肿瘤，病理类型包括鳞癌、腺癌等，是常见消化道恶性肿瘤之一。2018年全球食管癌发病率在恶性肿瘤中居第7位(6.3/100000)，死亡率居第6位(5.5/100000)。同年，我国食管癌发病率(13.9/100000)和死亡率(12.7/100000)在恶性肿瘤中分别居第5位和第4位，新发病例和死亡病例分别占全球总数的53.7％和55.7％。我国是食管癌发病率最高的国家，因此，快速攻克食管癌发病机制，实现早诊早治，降低食管癌死亡率和发病率是科研工作者的终极目标。食管癌发病模式在中西方国家之间差异显著，食管鳞状细胞癌是中国和亚洲地区食管癌最常见的组织学类型，占95％以上；而西方国家以食管腺癌为主(80％以上)，因此，西方的食管癌防治模式并不完全适用于我国。食管癌确切的发病因素仍不清楚。营养元素缺乏(如核黄素等)，亚硝胺及霉菌毒素是中国人食管癌主要危险因素；而吸烟、饮酒、反流性食管炎、Barrett′s食管等被认为是西方国家的食管癌主要危险因素，吸烟、饮酒对中国人食管癌患病风险的影响不明显。且食管癌患者早期主要临床症状相对并不特异，发现困难，因此95％患者在就诊时，疾病已经进展到中晚期，尽管采用综合手术治疗，五年生存率仅15-20％。传统胃镜筛查是食管癌早期诊断的主要途径，但因其诊断的侵入性和价格昂贵仍然限制了其在无症状人群筛查中的应用。因此，发现新的早期食管癌的生物标志物作为非侵入性筛查实验以提高食管癌的早期发现，提高患者的生存率是有巨大应用意义。人体免疫系统可对自身抗肿瘤相关抗原(Tumor-associatedAntigens,TAAs)产生体液免疫应答，引发大量自身抗体释放至血清中，且在癌症患者临床症状出现前3-5年即可被检测到，作为早期肿瘤患者新的可识别的生物标记物。因此，针对TAA血清自身抗体的检测可为早期无症状肿瘤患者的检测提供更灵敏且可行的方法，使其有望成为ESCC早期诊断的理想血清学标志物。同时，肿瘤高度异质性的特点，因此，结合多个肿瘤相关抗原来联合检测患者体内某类肿瘤的自身抗体，有利于大大提高肿瘤的检出率。RECK基因定位于第9p13-12区，长度约87kb，是新近发生的一种肿瘤抑制基因，在维持细胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，并可能参与调节细胞生长、肿瘤浸润、转移和血管形成。RFT2基因定位于20p13，是调控核黄素转运及吸收的关键基因，编码产物为核黄素转运蛋白，主要功能是将核黄素由细胞外转入细胞内。核黄素即维生素B2，不仅是生命活动重要营养元素，缺乏时与食管癌的发生发展有极为密切的关系。PTCH1基因定位于9q22,是Hedgehog(HH)信号通路异常激活与多种肿瘤发生密切相关的关键分子，突变后可使肿瘤细胞生长受限乃至凋亡。NOTCH1蛋白是NOTCH信号通路中的膜结合蛋白受体，协调活化的NOTCH通路参与组织细胞的正常生长发育过程，也与乳腺癌、胃癌和食管癌等多种肿瘤的发生有关。本研究团队之前研究发现，NOTCH1活化成分在食管癌组织细胞表达中明显高于癌旁组织。FAT4基因位于染色体4q28.1，共17个外显子，编码含4981个氨基酸的蛋白质，具有肿瘤抑制作用。目前研究发现，FAT4基因突变后，细胞增殖、侵袭和迁移能力增强。AJUBA基因位于人类染色体14q11.2,蛋白结构与LIM家族的其它成员相似，作为支架蛋白参与多种生物学过程，包括细胞黏附、迁移、增殖和存活等。P53是位于17p13短臂上重要的抑癌基因，调节细胞生长，当细胞核受到算是、缺氧等外界刺激时将转录激活大量下游基因，从而阻滞细胞周期进展，是迄今为止发现的与人类恶性肿瘤关系最为密切基因之一。YAP1基因位于11q22染色体，是Hippo通路的核心因子，在胃癌、食管癌、肝癌和结直肠癌等多种肿瘤中表达上调，且YAP1高表达可促进肿瘤新生血管生成，促进肿瘤细胞的上皮-间质转化，从而在肿瘤细胞的侵袭转移中发挥重要作用。本课题组最新基因组学和蛋白组学分析数据，将8种TAA联合检测，作为食管癌早期筛查诊断，未见相关文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供食管癌相关血清标志物组RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备贲门癌检测试剂盒中的应用，相应的，还提供了能够特异性检测食管癌中RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1组合表达水平的分子在制备贲门癌检测试剂盒中的应用。基于上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：肿瘤相关抗原RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备食管癌检测试剂盒中的应用。在上述应用中，所述检测是指通过酶联免疫吸附法进行的检测。本专利技术请求保护的第二个主题为；肿瘤相关抗原RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备早期筛查食管癌检测试剂盒中的应用。本专利技术请求保护的第三个主题为：一种用于食管癌检测的ELISA试剂盒，包括固相载体和被包被于固相载体上的RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白。上述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。进一步地，在上述试剂盒中，所述第二抗体带有可检测的标记物。优选地，在上述试剂盒中，所述样品稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，所述显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；所述终止液为2mol/L的浓硫酸；所述洗涤液为含0.05％吐温-20的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液(Ph7.4)。优选地，在上述试剂盒中，所述标记物为辣根过氧化物酶。优选地，在上述试剂盒中，所述第二抗体为RecA蛋白。优选地，在上述试剂盒中，所述阳性对照血清为P53阳性对照血清，所述阴性对照血清为P53阴性对照血清。更加优选地，所述P53阳性对照血清是使用间接ELISA和Westernblot方法检测P53抗体均为阳性的食管癌患者血清，所述P53阴性对照血清是使用间接ELISA和Westernblot方法检测P53抗体表达水平均为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。大量研究已表明P53基因在食管癌的发生发展过程中起十分重要的调节作用本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.肿瘤相关抗原RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备食管癌检测试剂盒中的应用。/n
【技术特征摘要】
1.肿瘤相关抗原RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备食管癌检测试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测是指通过酶联免疫吸附法进行的检测。
3.肿瘤相关抗原RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备早期筛查食管癌检测试剂盒中的应用。
4.一种用于食管癌检测的ELISA试剂盒，其特征在于，包括固相载体和被包被于固相载体上的RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白。
5.根据权利要求4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：王立东，杨苗苗，赵学科，宋昕，张毅，周胜理，范宗民，王苒，李贝，韩雪娜，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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