血清外泌体ANXA11在诊断胰腺癌中的应用制造技术

本发明专利技术涉及血清外泌体人膜联蛋白A11(Annexin A11,ANXA11)在诊断胰腺癌(pancreatic cancer,PC)中的应用。本发明专利技术公开血清外泌体ANXA11在诊断胰腺癌的产品中的应用；所述产品应用于点免疫印迹实验中检测胰腺癌标记物ANXA11、CA19‑9、CEA、ANXA11+CA19‑9、ANXA11+CEA。本发明专利技术还公开了检测试剂盒检测血清中ANXA11的检测方法，包括以下步骤：S1、通过抗原抗体反应检测血清中ANXA11的浓度；S2、采用电化学发光免疫分析法分别测定血清CA19‑9、CEA的水平；S3、统计分析：S4、绘制ROC曲线，评价观察指标的诊断效能。本发明专利技术针对PC的早期检出率问题，为PC诊断找到一个新的特异性诊断标志物血清外泌体ANXA11。

The application of serum exosomes ANXA11 in the diagnosis of pancreatic cancer

【技术实现步骤摘要】
血清外泌体ANXA11在诊断胰腺癌中的应用
本专利技术属于生物医药
，具体涉及血清外泌体人膜联蛋白A11(AnnexinA11,ANXA11)在诊断胰腺癌(pancreaticcancer,PC)中的应用。
技术介绍
胰腺癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，致死率极高，中位生存期不到6个月，5年生存率仅约5％。大部分PC患者早期无明显不适，发现时已处于晚期，错失了最佳的手术时机，大大降低患者的预后。糖类抗原19-9(carbohydrateantigen19-9,CA19-9)对PC的诊断有一定的价值，但敏感性和特异性均不够理想。因此，寻找筛查早期PC的肿瘤标志物对提高PC患者生存率显得尤为重要。外泌体(Exosome)是直径为50～200nm的小囊泡，可由多种细胞分泌，带有亲本细胞的多种蛋白质、DNA、RNA等重要信息。LaiX等发现外泌体中miR-10b、miR-21、miR-30c和miR-181a、let-7a诊断PC的效能优于CA19-9。可见寻找外泌体上的标志物有望提高PC的早期检出率。ANXA11是Ca2+调节的磷脂结合蛋白，与多数恶性肿瘤的发生发展及转移密切相关。本专利技术在前期阶段利用液相色谱质谱法(LC-MS)检测PC血清外泌体特异蛋白丰度，发现PC患者血清外泌体ANXA11水平明显高于胰腺炎及正常人，并验证了ANXA11在PC细胞及其分泌的外泌体中高表达，进一步采用基于质谱的靶向蛋白质组定量技术(PRM)验证发现ANXA11仅在血清外泌体中可检测到，而无外泌体血清中检测不出。r>目前，尚无关于血清外泌体ANXA11与PC发生发展关系的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供血清外泌体ANXA11在诊断胰腺癌中的应用，提高PC的早期检出率。本专利技术的实施例提供血清外泌体ANXA11在诊断胰腺癌的产品中的应用。进一步的，所述产品应用于点免疫印迹实验中检测胰腺癌标记物ANXA11、胰腺癌标记物CA19-9、胰腺癌标记物CEA、胰腺癌标记物ANXA11+CA19-9、胰腺癌标记物ANXA11+CEA。其中，所述点免疫印迹实验，包括以下步骤：(1)准备：将NC膜裁剪至70孔板相当大小，轻轻放置在70孔板上，连接负压吸引装置，负压值调至0.08MPa；(2)加样：设置对照孔和样本孔，每孔均设3个复孔，对照孔和样本孔分别加入对照血清样本和各待测血清样本1μL；加样结束后，将NC膜自然晾干20min；(3)用5％牛奶封闭；将硝酸纤维膜轻置于5％的脱脂奶粉溶液中，置于摇床上室温下封闭1.5h；其中，5％脱脂奶粉溶液使用TBS-T溶液稀释至溶度为5％；(4)洗膜；弃去封闭液，用TBS-T漂洗硝酸纤维膜1～2次；(5)孵育一抗：取一抗加入5％BSA溶液中按照稀释比为1:1000进行稀释，置4℃冰箱过夜；(6)洗膜；将硝酸纤维膜放入TBS-T中摇床上洗涤3次，每次5min；(7)孵育二抗：取二抗加入1×TBS-T溶液中按照稀释比为1:8000进行稀释，室温孵育1.5h；(8)洗膜；将硝酸纤维膜放入TBS-T中摇床上洗涤3次，每次15min；、(9)显影：将显影剂均匀滴加于NC膜上，用化学发光成像系统拍照、保存，显影所得图像用ImageJ软件统计各血清标本灰度值，并根据已知浓度对照血清的灰度值，转换其它样本的浓度。进一步的，所述产品为用于检测血清外泌体中ANXA11在胰腺癌患者血清中呈现高水平的检测试剂盒。更进一步的，所述检测试剂盒包括硝酸纤维素膜、TBS-T缓冲液、一抗、二抗、70孔板、牛血清白蛋白、显影剂。其中，所述一抗为鼠抗人ANXA11抗体；所述二抗为HRP-山羊抗小鼠抗体。其中，所述TBS-T缓冲液包括以下组分：Tris2.42g、NaCl8.0g、吐温1ml、双蒸水定容至1000ml。本专利技术的实施例另外还一种检测试剂盒检测血清中ANXA11的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、采用该试剂盒通过点免疫印迹实验将血清中所有的蛋白质吸附在NC膜上，通过抗原抗体反应检测血清中ANXA11的浓度；该步骤中的点免疫印迹实验与前述实验过程相同。S2、采用电化学发光免疫分析法分别测定血清CA19-9、CEA的水平。S3、统计分析：点免疫印迹实验测得的ANXA11水平以中位数表示，组内两两比较、PC患者手术前后的比较及ANXA11水平与临床病理参数的相关性分析中均采用Mann-WhitneyU检验。S4、绘制ROC曲线，计算曲线下面积，评价观察指标的诊断效能。专利技术的上述技术方案的有益效果如下：(1)本专利技术针对PC的早期检出率问题，为PC诊断找到一个新的特异性诊断标志物血清外泌体ANXA11。(2)本专利技术通过对胰腺癌标记物血清外泌体ANXA11的直接检测，对PC的早期诊断有重要价值，联合CA19-9可提高诊断敏感性。(3)本专利技术建立灵敏度较高、无需提取血清外泌体的点免疫印迹实验直接检测血清外泌体中ANXA11的水平，探讨血清外泌体ANXA11在PC诊断中的临床应用价值，为今后血清外泌体ANXA11在PC早期诊断、治疗监测及预后判断方面提供依据。附图说明图1为本专利技术中PRM法检测血清外泌体及无外泌体血清中的ANXA11蛋白丰度；图2为本专利技术中点免疫印迹法检测对照血清倍比稀释1～4倍后ANXA11结果；图中，A：对照血清倍比稀释1～4倍后ANXA11检测结果示例图；B：ANXA11检测浓度与灰度值散点图；图3为本专利技术中点免疫印迹法检测各组血清ANXA11的浓度；图中，A：PC组；B：胰腺炎组；C：胰腺良性占位组；D：健康对照组；图4为本专利技术中血清ANXA11、CA19-9、CEA诊断PC的ROC曲线；图5为本专利技术中手术治疗前后血清ANXA11浓度变化趋势图。具体实施方式为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。下述实施例中所使用的实验试剂及来源：硝酸纤维素膜(NC膜)：购自德国Sartorius公司产品(孔径0.22μm)；一抗：鼠抗人ANXA11抗体，购自SantaCruz公司，货号：sc-271486；二抗：HRP-山羊抗小鼠抗体，购自JacksonImmunoResearch，货号：115-035-003；牛血清白蛋白(BSA)：购自美国Sigma公司；TBS-T缓冲液：Tris2.42g，NaCl8.0g，吐温1ml，双蒸水定容至1000ml，置4℃冰箱保存；显影剂：购自苏州新赛美生物科技有限公司。化学发光成像系统：购自美国BioRad公司(ChemiDocXRS+型)；70孔板：实验本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.血清外泌体ANXA11在诊断胰腺癌的产品中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.血清外泌体ANXA11在诊断胰腺癌的产品中的应用。


2.根据权利要求1所述的血清外泌体ANXA11在诊断胰腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述产品应用于点免疫印迹实验中检测胰腺癌标记物ANXA11、胰腺癌标记物CA19-9、胰腺癌标记物CEA、胰腺癌标记物ANXA11+CA19-9、胰腺癌标记物ANXA11+CEA。


3.根据权利要求2所述的血清外泌体ANXA11在诊断胰腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述点免疫印迹实验，包括以下步骤：
(1)准备：将NC膜裁剪至70孔板相当大小，轻轻放置在70孔板上，连接负压吸引装置，负压值调至0.08MPa；
(2)加样：设置对照孔和样本孔，每孔均设3个复孔，对照孔和样本孔分别加入对照血清样本和各待测血清样本1μL；加样结束后，将NC膜自然晾干20min；
(3)用5％牛奶封闭；将硝酸纤维膜轻置于5％的脱脂奶粉溶液中，置于摇床上室温下封闭1.5h；其中，5％脱脂奶粉溶液使用TBS-T溶液稀释至溶度为5％；
(4)洗膜；弃去封闭液，用TBS-T漂洗硝酸纤维膜1～2次；
(5)孵育一抗：取一抗加入5％BSA溶液中按照稀释比为1:1000进行稀释，置4℃冰箱过夜；
(6)洗膜；将硝酸纤维膜放入TBS-T中摇床上洗涤3次，每次5min；
(7)孵育二抗：取二抗加入1×TBS-T溶液中按照稀释比为1:8000进行稀释，室温孵育1.5h；
(8)洗膜；将硝酸纤维膜放入TBS-T中摇床上洗涤3次，每次15min；
(9)显影：将显影剂均匀滴加于NC膜上，用化学发光成像系统拍照、保存，显影所得图像用ImageJ软件统计各血清标本...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖明兵，刘肇修，许敏雪，薛万江，陆玉华，郑文杰，李桃，徐伟松，王正栋，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32