一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测试剂盒，包括量子点标记的ACE2蛋白、量子点标记的兔IgG、重组冠状病毒棘突蛋白S1、羊抗兔IgG的多抗、以及免疫层析试纸条等材料。本发明专利技术通过量子点荧光标记和多级偶联放大信号提高检测灵敏度、利用配体与受体结合原理提高检测特异性并避开抗体研发周期，提供一种能够快速检测冠状病毒的试剂盒，通过建立病毒灭活系统保障检测过程中的生物安全性。本发明专利技术的试剂盒适合口腔黏膜液、呼吸道、全血、血浆、血清、排泄物等多种生物样本及环境样本的检测，可应用于SARS‑CoV‑19、SARS‑CoV、和HCoV‑NL63等以ACE2为受体的冠状病毒的快速检测。

A kit for rapid detection of coronavirus based on S-protein ligand and ACE2 receptor competitive chromatography

【技术实现步骤摘要】
一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒。
技术介绍
冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，感染宿主包括人、鼠、蝙蝠、猪、猫、穿山甲、犬、狼、鸡、牛、蛇类、禽类等脊椎动物。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-19,曾用名2019-nCoV)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。研究表明，其中SARS-CoV-19、SARS-CoV和HCoV-NL63是通过病毒包膜spikeglycoprotein(S-protein)介导病毒与宿主细胞膜上的ACE2受体相互作用来感染人的。在新疫情突发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒方法包含标记量子点的ACE2蛋白，标记量子点的ACE2蛋白制备方法包括以下步骤：/n1）将人源ACE2胞外域基因的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签形成人工设计序列，该人工设计序列经宿主细胞密码子优化后，亚克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达ACE2-定点生物素化序列-蛋白酶切位点标签-纯化标签融合蛋白的质粒，简称为ACE2融合蛋白的质粒；/n2）将步骤1）构建好的表达ACE2融合蛋白的质粒转染到真核永生化细胞，并建立表达ACE2融合蛋白...

【技术特征摘要】
1.一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于所述试剂盒方法包含标记量子点的ACE2蛋白，标记量子点的ACE2蛋白制备方法包括以下步骤：
1）将人源ACE2胞外域基因的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签形成人工设计序列，该人工设计序列经宿主细胞密码子优化后，亚克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下，构建表达ACE2-定点生物素化序列-蛋白酶切位点标签-纯化标签融合蛋白的质粒，简称为ACE2融合蛋白的质粒；
2）将步骤1）构建好的表达ACE2融合蛋白的质粒转染到真核永生化细胞，并建立表达ACE2融合蛋白的基因稳转细胞系，进行培养扩增得到含ACE2融合蛋白的培养上清液；
3）用蛋白纯化柱从步骤2）制备的含ACE2融合蛋白的培养上清液中获得ACE2融合蛋白，随后用特异性蛋白酶切去ACE2融合蛋白的纯化标签获得ACE2蛋白；
4）将步骤3）获得的ACE2蛋白用生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化，获得蛋白ACE2-Biotin；
5）将链霉亲和素SA偶联于羧基量子点微球，获得QM-SA；将步骤4）获得的ACE2-Biotin与QM-SA共孵育，获得牢固标记量子点的ACE2蛋白，将其标记为QM-SB-ACE2。


2.如权利要求1所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤1）中，所述人源ACE2胞外域基因为人源ACE2的细胞膜外部分，即GenBank:AB046569.1的1-739aa部分的编码基因序列；所述蛋白定点生物素化序列为生物素蛋白连接酶BirA，其识别位点序列为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW；所述特异性蛋白酶为EK酶，其切位点标签为Flag标签；所述纯化标签为小鼠IgGFc段；所述密码子优化的宿主为人；所述含有EF1启动表达荧光蛋白的载体为慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，EF1启动表达的荧光蛋白为绿色荧光蛋白copGFP，构建好的ACE2融合蛋白的质粒命名为pCDH-ACE2mFc.copGFP；
其中，在人源ACE2胞外域基因的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签的人工设计序列经宿主细胞密码子优化后的核酸序列如SEQIDNO：1所示，构建好的pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒所表达的ACE2融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。


3.如权利要求1所述的一种基于S蛋白配体与ACE2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒，其特征在于步骤2）中，所述真核永生化细胞为HEK293，建立表达ACE2融合蛋白的基因稳转细胞系为ACE2mFc.copGFP/293；
其中ACE2mFc.copGFP/293稳转细胞系的建立过程为：将pCDH-ACE2mFc.copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V，制备ACE2mFc.copGFP慢病毒，并转染HEK293细胞，荧光显微镜下挑取克隆建立ACE2mFc.copGFP/29...

【专利技术属性】
技术研发人员：范春雷，朱晓进，程向荣，
申请(专利权)人：浙江诺迦生物科技有限公司，杭州迈尔德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33