一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒，所述检测试剂盒分为检测组试剂和阴性对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3‑AM，所述阴性对照组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293、细胞内游离钙离子探针试剂Fluo 3‑AM以及大麻素受体拮抗剂。本发明专利技术可实现所有大麻素类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然大麻素、还是合成大麻素，包括层出不穷的新型合成大麻素活性物质，可解决大麻类精神活性物质监管难的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。
技术介绍
对于吸毒人员吸食大麻类毒品的检测和监管一直是各国监管部门的难题。因为目前的检测手段主要依赖于抗体(如抗四氢大麻抗体)的免疫法，包括层析法、ELISA法等；以及气质联用、液质联用等大型仪器分析。但大麻类在人体内代谢较快，造成检测样本中目标检测成分含量极低，无法检测到。另一方面，新型合成大麻素层出不穷，且分子结构多样，使基于抗体的免疫检测法几乎不可能，甚至气质联用、液质联用也无法检测。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。本专利技术构思为：无论是天然大麻素，还是各种各样的合成大麻素，其在机体内都会作用到大麻素受体这个靶点，从而产生其生物学效应。大麻素受体至少包括CB1、CB2两种类型，CB1主要存在于中枢神经系统中。大麻素受体属于GPCR类，当受到大麻素类分子激动剂作用后信号通路激活，即通过IP3-DAG信号通路使内质网内储存的Ca2+迅速释放到的细胞质，胞质内游离钙离子浓度升高，从而产生细胞应答；如果用麻素受体拮抗剂则作用相反。由于胞质内游离钙离子浓度的测定有非常成熟的方法，因而我们通过建立稳转CB1的细胞系，建立一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质快速、高效、精准、高通量的通用检测方法。所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）将大麻素受体CB1基因克隆到CMV启动子下构建真核表达质粒，将所述真核表达质粒转染到真核永生化细胞，并建立CB1稳转细胞系，进行培养扩增得到细胞培养液；2）步骤1）细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的5种标准液，将每种四氢大麻酚浓度的标准液均分为相同的2份；其中1份标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y1；另1份标准液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性标准液，阴性标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y2；以荧光值Y1与荧光值Y2之差为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程；3）步骤1）细胞培养液中加入待测样本，配制得到样本液；取2份相同的样本液，其中1份样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y3；另1份样本液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性样本液，阴性样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y4；计算荧光强度Y3与荧光强度Y4之差，并带入步骤2）回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质含量。所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤1）中，所述大麻素受体CB1基因为人源大麻素受体CB1基因；所述真核表达质粒为pCMV-CB1质粒，其制备过程为：将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoRI和NotI，构建所述pCMV-CB1质粒。所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤1）中，建立CB1稳转细胞系的过程为：将pCMV-CB1质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-CB1慢病毒；将CMV-CB1慢病毒感染人胚肾细胞293得到稳转CMV-CB1的293细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选稳转CMV-CB1的293细胞，并通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293。所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，向细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制四氢大麻酚浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ng/mL的5种标准液。所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，所述大麻素受体拮抗剂为Pyrazoles、Triazoles、Imidazoles或NESS 0327。所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3）中，所述待测样本为吸毒人员的尿液、血液、毛发、头皮屑、汗液或唾液，或者为天然大麻、天然大麻制品、合成大麻、合成大麻制品、污水、土壤、水塘中的任意一种。所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）和步骤3）中的细胞内游离钙离子探针试剂均为Fluo3-AM；步骤3）中，进行检测胞内游离荧光钙离子荧光强度的方法为：用荧光酶标仪进行测试，选择488nm波长激发，以526nm波长检测胞内游离荧光钙离子荧光值。所述的一种大麻素类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒分为检测组试剂和阴性对照组试剂两种成分，所述检测组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293和细胞内游离钙离子探针试剂Fluo3-AM，所述阴性对照组试剂包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/293、细胞内游离钙离子探针试剂Fluo3-AM以及大麻素受体拮抗剂。相对于现有技术，本专利技术取得的有益效果是：(1)避免了免疫检测法依赖于抗体的局限，可直接对所有大麻素类活性物质进行通用检测，没有非特异性结合问题，无需昂贵人力物力和繁复长周期的抗体研发过程；同时也避免了气质联用、液质联用法依赖于对照品的局限、有限的检测限、以及复杂的样品前处理工作。本专利技术的技术方案可实现所有大麻素类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然大麻素、还是合成大麻素，包括层出不穷的新型合成大麻素活性物质，可解决大麻类精神活性物质监管难的问题。(2)可利用成熟的胞质内游离钙离子浓度的测定技术定量检测分析。(3)可用通用的流式细胞仪、荧光酶标仪等方法测定，可在绝大多数普通实验室实现检测。(4)由于是基于受体信号通路的生物学效应的检测，结果不仅可正确判断是否是大麻素类活性物质，而且可以对其活性进行定量评估，为监管、和医学干预提供可靠的实验依据。(5)本专利技术提供一种稳转细胞系，其能够通过CB1的IP3-DAG信号通路对包括天然大麻素和合成大麻素在内的所有大麻素类活性物质产生应答，从而可应用于大麻素类活性物质的高灵敏的通用检测，该稳转细胞系中包含一个由CMV启动高表达基因CB1；当大麻素类活性物质作用于CB1时，即可启动IP3-DAG信号通路，使内质网内储存的Ca2+迅速释放到细胞质，胞质内游离Ca2+可瞬间提高百倍。因而可利用成熟的胞质内游离钙离子浓度的测定技术定量检测分析。另一方面，本专利技术提供了一种简单、快速、高效、灵敏(皮克级)、精确、高通量的大麻素类活性物质通用检测试剂盒，该检测试剂盒基于C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）将大麻素受体CB1基因克隆到CMV启动子下构建真核表达质粒，将所述真核表达质粒转染到真核永生化细胞，并建立CB1稳转细胞系，进行培养扩增得到细胞培养液；2）步骤1）细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的5种标准液，将每种四氢大麻酚浓度的标准液均分为相同的2份；其中1份标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y1；另1份标准液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性标准液，阴性标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y2；以荧光值Y1与荧光值Y2之差为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程；3）步骤1）细胞培养液中加入待测样本，配制得到样本液；取2份相同的样本液，其中1份样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y3；另1份样本液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性样本液，阴性样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y4；计算荧光强度Y3与荧光强度Y4之差，并带入步骤2）回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质含量。...

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）将大麻素受体CB1基因克隆到CMV启动子下构建真核表达质粒，将所述真核表达质粒转染到真核永生化细胞，并建立CB1稳转细胞系，进行培养扩增得到细胞培养液；2）步骤1）细胞培养液中加入四氢大麻酚，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的5种标准液，将每种四氢大麻酚浓度的标准液均分为相同的2份；其中1份标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y1；另1份标准液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性标准液，阴性标准液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性标准液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y2；以荧光值Y1与荧光值Y2之差为纵坐标，以四氢大麻酚的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程；3）步骤1）细胞培养液中加入待测样本，配制得到样本液；取2份相同的样本液，其中1份样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y3；另1份样本液中加入过量的大麻素受体拮抗剂得到阴性样本液，阴性样本液中加入细胞内游离钙离子探针试剂，充分反应，对反应后的阴性样本液进行检测胞内游离荧光钙离子荧光值Y4；计算荧光强度Y3与荧光强度Y4之差，并带入步骤2）回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质含量。2.如权利要求1所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤1）中，所述大麻素受体CB1基因为人源大麻素受体CB1基因；所述真核表达质粒为pCMV-CB1质粒，其制备过程为：将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoRI和NotI，构建所述pCMV-CB1质粒。3.如权利要求2所述的一种基于细胞内游离钙离子浓度变化效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤1）中，建立CB1稳转细胞系的过程...

【专利技术属性】
技术研发人员：范春雷，程向荣，
申请(专利权)人：浙江诺迦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33