【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断试剂盒
本专利技术属于生物
,具体涉及一种新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断试剂盒。
技术介绍
冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股RNA病毒,直径约80~120nm,其遗传物质是所有RNA病毒中最大的,感染宿主包括人、鼠、蝙蝠、猪、猫、穿山甲、犬、狼、鸡、牛、蛇类、禽类等脊椎动物。2019新型冠状病毒(SARS-CoV-19,曾用名2019-nCoV)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒,其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。在新疫情突发时,如2019新型冠状病毒肺炎(COVID-19),新病毒的早期检测一般采用核酸检测的方法,因为病毒的基因组可以很快被破译,随即可合成特异性核酸荧光探针制备荧光定量PCR检测试剂盒投入使用。该方法具有技术成熟、研发周期短、特异性好等优点;但同时也存在样本需前处理、检测时间长、需专业仪器专业人员操作、以及试剂贵等缺点,而且也存在一定的假阴性。血清中抗病毒-IgM抗体是病毒复制和早期感染的标志,随后会有IgG抗体升高。因而血清学IgM/IgG抗体通常作为病毒感染的检测指标,且可判断近期感染和继往感染。如HIV1/2、HBV、HCV、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒等的血清学IgM/IgG检测。同样,2019 ...
【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒,其特征在于包括S-IgM/IgG和N-IgM/IgG两种试纸条,所述S-IgM/IgG和N-IgM/IgG两种试纸条并排组装于一个双卡条中,构成一个双抗原四联检试剂卡;/n所述S-IgM/IgG试纸条和N-IgM/IgG试纸条均包括免疫层析试纸条,所述免疫层析试纸条包括底衬、硝酸纤维素膜、样品垫、释放垫和吸水纸;所述样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上,释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端,并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区,样品垫叠压在释放垫上;所述检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的二条检测线区M和G线、靠近吸水纸的一条控制线区C线;/n将质控抗原偶联于羧基量子点微球,获得QM-质控抗原;/n将量子点标记的新型冠状病毒棘突蛋白和QM-质控抗原混合喷涂在一个免疫层析试纸条的释放垫上,并在该免疫层析试纸条的M、G、C线区上分别包被第一检测抗体、第二检测抗体和质控抗体,获得所述的S-IgM/IgG试纸条;/n将量子点标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白和QM-质控抗原混合喷涂在另一个免疫层析试纸条的释放垫上,并在该免 ...
【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒,其特征在于包括S-IgM/IgG和N-IgM/IgG两种试纸条,所述S-IgM/IgG和N-IgM/IgG两种试纸条并排组装于一个双卡条中,构成一个双抗原四联检试剂卡;
所述S-IgM/IgG试纸条和N-IgM/IgG试纸条均包括免疫层析试纸条,所述免疫层析试纸条包括底衬、硝酸纤维素膜、样品垫、释放垫和吸水纸;所述样品垫、释放垫、硝酸纤维素膜和吸水纸搭接组装在底衬上,释放垫和吸水纸分别叠压在硝酸纤维素膜的两端,并在硝酸纤维素膜的表面形成检测区,样品垫叠压在释放垫上;所述检测区的硝酸纤维素膜上设置靠近释放垫的二条检测线区M和G线、靠近吸水纸的一条控制线区C线;
将质控抗原偶联于羧基量子点微球,获得QM-质控抗原;
将量子点标记的新型冠状病毒棘突蛋白和QM-质控抗原混合喷涂在一个免疫层析试纸条的释放垫上,并在该免疫层析试纸条的M、G、C线区上分别包被第一检测抗体、第二检测抗体和质控抗体,获得所述的S-IgM/IgG试纸条;
将量子点标记的新型冠状病毒核衣壳蛋白和QM-质控抗原混合喷涂在另一个免疫层析试纸条的释放垫上,并在该免疫层析试纸条的M、G、C线区上分别包被第一检测抗体、第二检测抗体和质控抗体,获得所述的N-IgM/IgG试纸条。
2.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒,其特征在于所述质控抗原为兔IgG,QM-质控抗原为QM-兔IgG;所述第一检测抗体为小鼠抗人IgM的单克隆抗体hIgM-mAb,第二检测抗体为小鼠抗人IgG的单克隆抗体hIgG-mAb,质控抗体为羊抗兔IgG多克隆抗体GAR。
3.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒,其特征在于将量子点标记的新型冠状病毒棘突蛋白命名为QM-SB-S,其制备方法包括以下步骤:
S1:将新型冠状病毒棘突蛋白标记为S-蛋白,在S-蛋白膜外部分的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签形成人工设计序列,该人工设计序列经宿主密码子优化,基因合成后亚克隆到一个含有EF1启动表达荧光蛋白的载体的CMV启动子下,构建表达该人工设计序列蛋白的质粒,标记为S-融合蛋白质粒;
S2:将步骤S1构建的S-融合蛋白质粒转染到真核永生化细胞,并建立S-融合蛋白基因稳转细胞系,进行培养扩增得到含S-融合蛋白的培养上清液,用纯化蛋白亲和柱从该培养上清液中获得S-融合蛋白,随后用特异性蛋白酶切去S-融合蛋白的纯化标签获得S-蛋白;
S3:将步骤S2获得的S-蛋白用生物素蛋白连接酶使其C-末端定点生物素化,获得蛋白S-Biotin;将链霉亲和素SA偶联于羧基量子点微球,获得QM-SA;将蛋白S-Biotin与QM-SA共孵育,获得牢固标记量子点的S-蛋白,标记为QM-SB-S。
4.如权利要求3所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒,其特征在于步骤S1中,所述S-蛋白膜外部分即为NCBIReferenceSequence:YP_009724390.1的1-1213aa部分;S-蛋白膜外部分的C端顺序接上的蛋白定点生物素化序列的生物素蛋白连接酶识别位点为GSGGSGGSAGGGLNDIFEAQKIEW、特异性蛋白酶的切位点标签为Flag标签DYKDDDDK、纯化标签为小鼠IgGFc段;密码子优化的宿主为人;所述含有EF1启动表达荧光蛋白的载体为慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,该EF1启动表达的荧光蛋白为绿色荧光蛋白copGFP,构建的S-融合蛋白质粒是pCDH-nCoVSmFc.copGFP;
其中,在S-蛋白膜外部分的C端顺序接上蛋白定点生物素化序列、特异性蛋白酶切位点标签和纯化标签的人工设计序列经宿主密码子优化后的核酸序列如SEQIDNO:1所示;构建好的pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒所表达的S-融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
5.如权利要求3所述的一种新型冠状病毒肺炎COVID-19血清学诊断试剂盒,其特征在于步骤S2中,所述真核永生化细胞为HEK293,建立S-融合蛋白基因稳转细胞系的过程为:将pCDH-nCoVSmFc.copGFP质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染到慢病毒包装系细胞293V,制备nCoVSmFc.copGFP慢病毒,并转染HEK293细胞,荧光显微镜下挑取克隆建立...
【专利技术属性】
技术研发人员:范春雷,朱晓进,程向荣,
申请(专利权)人:浙江诺迦生物科技有限公司,杭州迈尔德生物科技有限公司,
类型:发明
国别省市:浙江;33
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