一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒，所述检测试剂盒包括检测组试剂盒和对照组试剂盒两种成分，所述检测组试剂盒包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/SK‑N‑SH和ELISA检测试剂盒，所述对照组试剂盒包括空白对照细胞系Neo/SK‑N‑SH和ELISA检测试剂盒。本发明专利技术可实现所有大麻素类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然大麻素、还是合成大麻素，包括层出不穷的新型合成大麻素活性物质，可解决大麻类精神活性物质监管难的问题，快速、高效、精准、高通量的检测各种样品中的大麻素类活性物质。

【技术实现步骤摘要】
一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。
技术介绍
对于吸毒人员吸食大麻类毒品的检测和监管一直是各国监管部门的难题。因为目前的检测手段主要依赖于抗体(如抗四氢大麻抗体)的免疫法，包括层析法、ELISA法等；以及气质联用、液质联用等大型仪器分析。但大麻类在人体内代谢较快，造成检测样本中目标检测成分含量极低，无法检测到。另一方面，新型合成大麻素层出不穷，且分子结构多样，使基于抗体的免疫检测法几乎不可能，甚至气质联用、液质联用也无法检测。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法及其检测试剂盒。本专利技术构思为：无论是天然大麻素，还是各种各样的合成大麻素，其在机体内都会作用到大麻素受体这个靶点，从而产生其生物学效应。大麻素受体至少包括CB1、CB2两种类型，CB1主要存在于中枢神经系统中。大麻素受体属于GPCR类，当受到大麻素类分子激动剂作用后信号通路激活，即通过IP3-DAG信号使内质网内储存的Ca2+迅速释放到的细胞质，胞质内游离钙离子浓度升高，从而产生细胞应答，如神经细胞释放多巴胺。由于多巴胺的测定有成熟的ELISA检测试剂盒，因而我们通过建立稳转CB1的神经母细胞瘤细胞系CB1/SK-N-SH，建立一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质检测方法，应用于快速、高效、精准、高通量的检测各种样品中的大麻素类活性物质。所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoRI和NotI，构建真核表达pCMV-CB1质粒；2）将步骤1）pCMV-CB1质粒转染到神经母细胞瘤细胞，并建立CB1稳转的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到检测组细胞培养液；同时以慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo为对照空载体，建立一个转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到对照组细胞培养液；3）步骤2）检测组细胞培养液中加入四氢大麻酚并充分反应，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的标准液；将标准液离心分离后，取上清液并用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD值，以测得的吸光度OD值为纵坐标，以标准液中的四氢大麻酚浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；4）步骤2）检测组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的检测组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD1值；步骤2）对照组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的对照组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD2值；计算吸光度OD1值与吸光度OD2值之差，并带入步骤3）回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质的效应含量。所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，神经母细胞瘤细胞为SK-N-SH细胞。所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，建立CB1稳转的神经母细胞瘤细胞系的过程为：将pCMV-CB1质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-CB1慢病毒；将CMV-CB1慢病毒感染SK-N-SH细胞得到CB1/SK-N-SH稳转细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选CB1/SK-N-SH稳转细胞，并通过挑取克隆的方法获得稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/SK-N-SH。所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，建立转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系的过程为：将pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo对照空载体、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到空载体慢病毒；将空载体慢病毒感染SK-N-SH细胞得到Neo/SK-N-SH稳转细胞，用含新霉素G418的条件培养基筛选Neo/SK-N-SH稳转细胞，并通过挑取克隆的方法获得空白对照细胞系Neo/SK-N-SH。所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤3）中，向检测组细胞培养液中加入四氢大麻酚并充分反应，配制四氢大麻酚浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ng/mL的5种标准液；其中进行充分反应的过程为：混匀，35~40℃反应3~10分钟。所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤4）中，其中进行充分反应的过程为：混匀，35~40℃反应3~10分钟。所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤4）中，所述待测样本为吸毒人员的尿液、血液、毛发、头皮屑、汗液或唾液，或者为天然大麻、天然大麻制品、合成大麻、合成大麻制品、污水、土壤、水塘中的任意一种。所述的一种大麻素类活性物质的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包括检测组试剂盒和对照组试剂盒两种成分，所述检测组试剂盒包括稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/SK-N-SH和ELISA检测试剂盒，所述对照组试剂盒包括空白对照细胞系Neo/SK-N-SH和ELISA检测试剂盒。相对于现有技术，本专利技术取得的有益效果是：(1)避免了免疫检测法依赖于抗体的局限，可直接对所有大麻素类活性物质进行通用检测，没有非特异性结合问题，无需昂贵人力物力和繁复长周期的抗体研发过程；同时也避免了气质联用、液质联用法依赖于对照品的局限、有限的检测限、以及复杂的样品前处理工作。本专利技术的技术方案可实现所有大麻素类活性物质的精确、高灵敏的快速检测，无论是天然大麻素、还是合成大麻素，包括层出不穷的新型合成大麻素活性物质，可解决大麻类精神活性物质监管难的问题。(2)可利用现有的多巴胺ELISA检测试剂盒定量检测分析。(3)可用通用的荧光酶标仪测定，可在绝大多数普通实验室实现检测。(4)由于是基于受体信号通路的生物学效应的检测，结果不仅可正确判断是否是大麻素类活性物质，而且可以对其活性进行定量评估，为监管、和医学干预提供可靠的实验依据。(5)本专利技术提供一种稳定表达人源大麻素受体CB1基因的单克隆细胞系CB1/SK-N-SH，其能够通过CB1的IP3-DAG信号通路对包括天然大麻素和合成大麻素在内的所有大麻素类活性物质产生应答，细胞释放多巴胺，从而可应用于大麻素类活性物质的高灵敏的通用检测，该稳转神经母细胞瘤细胞系中包含一个由CMV启动高表达基因CB1，当大麻素类活性物质作用于CB1时，即可启动IP3-DAG信号通路，使神经细胞迅速释放多巴胺；因而可利用现有的多巴胺检测试剂盒定量检测分析。另一方面，本专利技术提供了一种简单、快速、高效、灵敏(皮克级)、精确、高通量的大麻素类活性物质通用检测试剂盒，该检测试剂盒基于CB1受体的IP3-DAG信号通路，通过检测细胞迅速释放的多巴胺检测来实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoR I和Not I，构建真核表达pCMV‑CB1质粒；2）将步骤1）pCMV‑CB1质粒转染到神经母细胞瘤细胞，并建立CB1稳转的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到检测组细胞培养液；同时以慢病毒表达载体pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑Neo为对照空载体，建立一个转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到对照组细胞培养液；3）步骤2）检测组细胞培养液中加入四氢大麻酚并充分反应，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的标准液；将标准液离心分离后，取上清液并用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD值，以测得的吸光度OD值为纵坐标，以标准液中的四氢大麻酚浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；4）步骤2）检测组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的检测组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD1值；步骤2）对照组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的对照组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD2值；计算吸光度OD1值与吸光度OD2值之差，并带入步骤3）回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质的效应含量。...

【技术特征摘要】
1.一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）将人源大麻素受体CB1基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo的CMV启动子下，连接酶切位点为EcoRI和NotI，构建真核表达pCMV-CB1质粒；2）将步骤1）pCMV-CB1质粒转染到神经母细胞瘤细胞，并建立CB1稳转的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到检测组细胞培养液；同时以慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Neo为对照空载体，建立一个转染对照空载体的神经母细胞瘤细胞系，进行培养扩增得到对照组细胞培养液；3）步骤2）检测组细胞培养液中加入四氢大麻酚并充分反应，配制一系列不同四氢大麻酚浓度的标准液；将标准液离心分离后，取上清液并用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD值，以测得的吸光度OD值为纵坐标，以标准液中的四氢大麻酚浓度为横坐标绘制标准曲线，计算拟合回归方程；4）步骤2）检测组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的检测组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD1值；步骤2）对照组细胞培养液中加入待测样本，充分反应，离心分离后取上清液，对反应后的对照组细胞培养液的上清液用ELISA检测试剂盒检测多巴胺效应下的吸光度OD2值；计算吸光度OD1值与吸光度OD2值之差，并带入步骤3）回归方程，即可推算出待测样本中的大麻素类活性物质的效应含量。2.如权利要求1所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，神经母细胞瘤细胞为SK-N-SH细胞。3.如权利要求2所述的一种基于细胞多巴胺释放效应的大麻素类活性物质的检测方法，其特征在于步骤2）中，建立CB1稳转的神经母细胞瘤细胞系的过程为：将pCMV-CB1质粒、pH1质粒、pH2质粒共转染至慢病毒包装细胞293V，制备得到CMV-CB1慢病毒；将CMV-CB1慢病毒感染SK-N...

【专利技术属性】
技术研发人员：范春雷，程向荣，
申请(专利权)人：浙江诺迦生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33