用于检测犬癌的装置及方法制造方法及图纸

发现在患有癌症的犬中犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A(ECPKA)蛋白以高水平分泌，并形成对犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A蛋白的自身抗体。还发现人细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A不能选择性地与犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A自身抗体相结合，且不能充当生物标志物。并且，犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A自身抗体检测仅在采用这种抗体的定量测定的情况下可用作对犬的癌症的有意义的诊断工具。在犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A自身抗体的测定不确定的情况下，测定C反应蛋白(CRP)可提供补充数据，其可用于提高以下进一步描述的测定犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A自身抗体的预测可能性。

Device and Method for Canine Cancer Detection

It was found that canine extracellular adenosine phosphate dependent protein kinase A (ECPKA) protein was secreted at a high level in cancerous dogs and formed autoantibodies against canine extracellular adenosine phosphate dependent protein kinase A protein. It was also found that human extracellular adenosine phosphate dependent protein kinase A could not selectively bind to canine extracellular adenosine phosphate dependent protein kinase A autoantibody and could not act as a biomarker. Furthermore, the detection of autoantibodies to adenosine-dependent protein kinase A (ADPKA) in canine extracellular domain can be used as a useful diagnostic tool for canine cancer only when the quantitative determination of this antibody is used. In the case of uncertainty in the determination of autoantibodies to canine extracellular adenosine phosphate-dependent protein kinase A, the determination of C-reactive protein (CRP) can provide additional data, which can be used to improve the predictive possibility for the determination of canine extracellular adenosine phosphate-dependent protein kinase A autoantibodies described below.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测犬癌的装置及方法
本专利技术涉及使用犬(cannine)PKCCα蛋白作为抗原来检测犬癌症的装置及方法。检测方法及装置利用以治疗上有意义的选择性、特异性地可与犬PKCCα蛋白或其亚基相结合的抗体的定量检测。
技术介绍
人类和犬在遗传及免疫学上有许多相似之处，但同时也表现出许多不同的免疫反应和生物反应。例如，人类容易被艾滋病感染，但是犬对上述病毒有抗性。并且，犬容易被犬瘟热感染，但人类不是。潜在的生物标志物对人类有用但对犬无用的不同的例子有很多。例如，众所周知，S期-特异性蛋白胸苷激酶1(TK1)为对如文献(H.vonEulerandS.Eriksson,VetCompOncol.2011Mar,9(1):1-15.doi:10.1111/j.l476-5829.2010.00238.x.Epub2010Aug19)所述的人类癌有用的生物标志物。S期-特异性蛋白胸苷激酶1的表达与S期细胞的比例和增殖水平密切相关。在正常细胞中，S期-特异性蛋白胸苷激酶1活性仅存在于后期G1期及早期S期，但是在许多肿瘤细胞中S期-特异性蛋白胸苷激酶1活性更高，并在整个S期及G2期一直维持。过度不受控制的细胞增殖是癌症的特征之一。因此，已经研究了S期-特异性蛋白胸苷激酶1活性水平以判定其与癌症的相关性，并且已经证明可用于诊断和监测肿瘤，例如包括乳腺癌在内的实体瘤。并且，S期-特异性蛋白胸苷激酶1的主要优点是几种单克隆抗体及多克隆抗体可与S期-特异性蛋白胸苷激酶1相结合。最具有特异性和敏感性的S期-特异性蛋白胸苷激酶1抗体是针对表示S期-特异性蛋白胸苷激酶1的C-末端的31-氨基酸肽产生的。S期-特异性蛋白胸苷激酶1的蛋白序列同源性在人与犬之间是高的(H.vonEulerandS.Eriksson)。犬S期-特异性蛋白胸苷激酶1和人S期-特异性蛋白胸苷激酶1的一级氨基酸序列在距N-末端约200个氨基酸中同源性非常高，但C-末端区域是不同的。尽管人与犬之间的蛋白序列具有高同源性，但发现在包括乳腺癌在内的4种不同实体瘤的犬中S期-特异性蛋白胸苷激酶1值在正常范围之内(NakamuraN,MomoiY,WatariT,YoshinoT,TsujimotoHandHasegawaA.,Plasmathymidinekinaseactivityindogswithlymphomaandleukemia,theJournalofVeterinaryMedicalScience1997；59:957-960)。并且，在50只具有实体瘤的已检查的犬中，只有3只显示S期-特异性蛋白胸苷激酶1活性增加(Monitoringtherapyincaninemalignantlymphomaandleukemiawithserumthymidinekinase1activity-evaluationofanew,fullyautomatednon-radiometricassay.InternationalJournalofOncology2008；34：505-510)。犬S期-特异性蛋白胸苷激酶1与人S期-特异性蛋白胸苷激酶1不同，它不是用于检测犬癌症的有用的生物标志物。并且，针对人S期-特异性蛋白胸苷激酶1诱导的最敏感且选择性抗体无法识别犬S期-特异性蛋白胸苷激酶1(H.vonEulerandS.Eriksson)。同样，针对相似区域的犬S期-特异性蛋白胸苷激酶1诱导的抗体可能不被人S期-特异性蛋白胸苷激酶1蛋白识别的可能性高。在哺乳动物细胞中介导环磷酸腺苷(cAMP)作用的作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A(PKA)参与细胞增殖、分化、代谢作用及凋亡(apoptosis)等多种生物过程的控制。蛋白激酶A的失调与癌症的发生和进展有关，事实上，在不同种类的人类癌症中经常观察到其过表达。因此，已经提出蛋白激酶A作为人类癌症的诊断生物标志物的潜在分子靶标。非活性蛋白激酶A全酶(holoenzyme)是由2个催化亚基和2个调节亚基构成的四聚体。如与调节亚基的环磷酸腺苷相结合，则非活性蛋白激酶A四聚体被解离成调节亚基的1个二聚体和活性催化亚基的2个单体，接着，在核和细胞质中均对多种靶蛋白进行磷酸化。通过生物化学研究鉴定了作为调节亚基的4种同种型(isoform)的RIα、RIβ、RIIα及RIIβ，并且蛋白激酶A信号传递激活结果依赖于细胞内调节亚基同种型的种类。在正常组织中优先观察到RII同种型的表达并抑制细胞生长，相反地，RI同种型(RIα/蛋白激酶A-1)的表达刺激细胞增殖。尤其，RIα/蛋白激酶A-I的过表达与癌症的进行、多剂耐性及预后不良的多种癌症患者高度相关。有趣的是，最近的研究表明，蛋白激酶A大多数表达在细胞内，而蛋白激酶A的细胞外形态(ECPKA)从许多类型的癌细胞系中分泌，包括前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌及肺腺癌。并且，在来源于患有多种癌症的患者的血清中高度检测到细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A，但在来源于健康的志愿者的血清中未检测到。并且，在人黑色素患者中外科切除肿瘤后，显示细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A的血清水平降低。参照报告使用人细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A作为抗原来检测抗-细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A的自身抗体的组合物及方法的美国专利第7838305B2号。这种观察结果示出血清中的人细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A及自身抗体可成为对人类癌症的有价值的诊断剂的可能性。犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A具有与人细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A不同的氨基酸序列。氨基酸序列如图1所示。不同序列遍布在包括C-末端在内的整个链。犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A是否存在于不患癌的犬中，尤其是存在于犬中的犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A的水平是否与癌的存在具有相关性是尚不清楚。进而，无论犬是否对产生自身抗体的犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A具有免疫反应，但尚不清楚这种免疫反应是否足够强大，以对用于检测犬癌症的生物标志物有用。也尚不清楚作为用于诊断犬癌症的目的的抗原是否可使用人细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A。典型地，血浆中如细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A的抗原的水平可随时间的推移而衰减，并且可能难以采用用于诊断测定的抗原的定量分析。抗原水平的检测可能不是用于以一定概率诊断或检测的有用工具，因为在检测样品之前的样品的保留时间有可能影响结果。但是，对于自身抗体的水平，这种衰减更少，尤其当需要定量控制时可以有用地用作生物标志物。通过对具有多种癌症的犬的不同品种及年龄的广泛调查和研究，发现犬具有可用于检测癌的存在的独特的犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A及自身抗体活性，人细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A与犬癌症的检测之间完全没有或几乎没有相关性。由于固有的特殊性，优选定量检测与犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A相关的抗体而不是简单的定性检测，并已经开发了能够进行这种定量检测的装置。尤其，开发了使用于数字化数据处理的定量检测，并且开发了支持这种数字化处理的装置。
技术实现思路
在一实施方式中，提供如下的方法，即，制备来源于犬的血清样品，使用纯化的重组犬PKCCα蛋白作为抗原来检测血清样品中的抗体的量，从本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种侧向流动试剂盒，用于定量检测犬血中的犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A抗体，其特征在于，包括：第一固相，具有固定的纯化的具有包含序列5的氨基酸序列的重组犬PKC Cα蛋白；接合垫，包含与第一结合蛋白接合而成的具有光学密度的接合的着色剂；以及第二固相，包含第二结合蛋白，上述接合的着色剂在第一固相中提供第一颜色强度，在第二固相中提供第二颜色强度，第一颜色强度以定量的方式依赖于犬血中抗体的浓度，第二颜色强度与抗体的浓度无关。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.10 US 62/405,9961.一种侧向流动试剂盒，用于定量检测犬血中的犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A抗体，其特征在于，包括：第一固相，具有固定的纯化的具有包含序列5的氨基酸序列的重组犬PKCCα蛋白；接合垫，包含与第一结合蛋白接合而成的具有光学密度的接合的着色剂；以及第二固相，包含第二结合蛋白，上述接合的着色剂在第一固相中提供第一颜色强度，在第二固相中提供第二颜色强度，第一颜色强度以定量的方式依赖于犬血中抗体的浓度，第二颜色强度与抗体的浓度无关。2.根据权利要求1所述的侧向流动试剂盒，其特征在于，上述接合的着色剂的光学密度为5至30。3.根据权利要求1所述的侧向流动试剂盒，其特征在于，上述接合的着色剂的光学密度为10至20。4.根据权利要求1所述的侧向流动试剂盒，其特征在于，上述侧向流动试剂盒以至少80％的特异性和至少80％的灵敏度从犬中检测癌症。5.根据权利要求1所述的侧向流动试剂盒，其特征在于，上述第一颜色强度通过对第一颜色强度与第一颜色强度和抗体的浓度间的相关数据集进行比较来提供抗体的浓度。6.根据权利要求5所述的侧向流动试剂盒，其特征在于，相关数据集的一部分能够通过线性方程来近似地表示，并且在第一颜色强度与任何相关数据集都不完全一致时其能够用于确定浓度。7.根据权利要求1所述的侧向流动试剂盒，其特征在于，上述第一结合蛋白选自由能够与链亲和素、生物素、蛋白A、抗-犬免疫球蛋白G大鼠、抗-犬免疫球蛋白G兔子、抗-犬免疫球蛋白G山羊、抗-犬免疫球蛋白G羊及抗体相结合的蛋白质组成的组中。8.根据权利要求1所述的侧向流动试剂盒，其特征在于，上述第二结合蛋白选自由能够与链亲和素、生物素、蛋白A、抗-大鼠免疫球蛋白G、抗-兔子免疫球蛋白G、抗-山羊免疫球蛋白G、抗-羊免疫球蛋白G及免疫球蛋白G相结合的蛋白质组成的组中。9.根据权利要求1所述的侧向流动试剂盒，其特征在于，上述着色剂选自由金、乳胶、绿色荧光蛋白、异硫氰酸荧光素及紫外线活性接合剂组成的组中。10.根据权利要求1所述的侧向流动试剂盒，其特征在于，还包含用于过滤血球的过滤相。11.一种用于确定犬血中犬细胞外环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A抗体的浓度的方法，其特征在于，包括：步骤(a)，为了使用于侧向流动试剂盒，从犬血液中制备检查样品；步骤(b)，将检查样品适用于侧向流动试剂盒；步骤(c)，使侧向流动试剂盒显色；步骤(d)，通过拍摄包括检查线的已显色的侧向流动试剂盒的数字照片来获得数字信息；以及步骤(e)，作为获得抗体的浓度的步骤，通过对使数字值与抗体的浓度相关的数据集与数字信息进行比较来确定上述浓度，上述侧向流动试剂盒包括：第一固相，具有固定的纯化的具有包含序列5的氨基酸序列的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：房东河，
申请(专利权)人：房东河，
类型：发明
国别省市：韩国,KR