氯霉素药物残留快速检测试纸条制造技术

本发明专利技术试纸条属于食品安全快速检测领域。试纸条包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，结合物释放垫的部分区域覆盖于样品吸收垫之下。在反应膜上包被有氯霉素‑载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠IgG构成的质控线；结合物释放垫包被有氯霉素的胶体金标记物。该试纸条可以延长检测结果观察时间，样品吸收垫也可以将检测液充分吸收与金标抗体完全接触而充分反应，再层析至反应膜上进行反应，可以有效的减少误差。还可以防止检测样本中的一些干扰成份使金标抗体中的蛋白失去活性，影响金标抗体与包被原的结合。

Test strip for rapid detection of chloramphenicol residues

The test strip of the invention belongs to the field of fast food safety detection. The test strip consists of a bottom plate, a sample pad attached to the bottom plate in turn, a bond release pad, a reaction film and a water absorbent pad. Some areas of the bond release pad are covered under the sample absorption pad. The reaction membrane was coated with a detection line consisting of chloramphenicol carrier protein conjugates and a quality control line consisting of sheep anti-mouse IgG. The conjugate release pad was coated with a colloidal gold label containing chloramphenicol. The test strip can prolong the observation time of the test results, and the sample absorption pad can also fully absorb the test solution and fully react with the gold-labelled antibody, and then react on the reaction membrane by chromatography, which can effectively reduce the error. It can also prevent some interfering components from inactivating the protein in the gold label antibody and affecting the binding of the gold label antibody to the coated original.

【技术实现步骤摘要】
氯霉素药物残留快速检测试纸条
本专利技术涉及一种检测氯霉素药物残留快速检测试纸条，属于食品安全快速检测领域。技术背景氯霉素是一种广谱抗生素，常用于动物各种传染病的治疗，对于多种病原菌有较强的抑制作用。氯霉素存在严重的副作用，能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障碍性贫血等疾病，因此动物食品中的氯霉素残留对人类的健康构成巨大威胁。目前有关动物源性食品中氯霉素及其代谢物的测定方法主要为理化检测法，如用化学分析法测定虾肉中的氯霉素残留量，检出限为0.0125ug/kg，用高效液相色谱法测定鱼肉中的氯霉素残留量，检出限为0.0125ug/kg。但这些方法仪器设备昂贵，操作复杂，灵敏度低，且不适用于大批量样品的检测，无法满足国内食品安全检测市场的迫切需要。免疫分析技术以其抗原抗体反应的高度专一性，以及测定方法简单、快速、灵敏度高、费用低和适于现场大批量样品筛选等优点，在农兽药残留分析中展示了广泛的应用前景。随着农药残留免疫学检测技术不断被完善和商品化，免疫学检测技术会成为食品农兽药残留和食品安全质量控制的有效快速检测手段。基于目前兽药残留诊断试剂的研究现状，及时开发出优于目前的、快速灵敏的检测试剂可谓是当务之急。虽然农兽药残留分析的方法虽然有很多，但是利用免疫学技术进行分析是特异性最好、检测时间最短的方法。现有技术对于氯霉素的检测主要是气相色谱-质谱法、高效液相色谱法等检测方法，但这些技术的缺陷明显：设备昂贵、操作复杂、难以推广。所以，建立一种简单、有效、适合基层使用的测定方法是极其必要的。本专利技术的目的是研制一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉的定性检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的:研制出特异、敏感、快速、简便的氯霉素药物残留快速检测试纸条。本专利技术的技术方案:一种氯霉素药物残留快速检测试纸条，底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护膜固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为纤维层，吸附金标抗体纤维层，纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联氯霉素药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“Ⅱ”。支撑层是用不吸水的硬质塑胶片条或硬纸条制成。测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、或聚酚膜制成，优选玻璃棉。吸水材料层用吸水纸制成。纤维素膜层用硝酸纤维素膜、或纯纤维素膜，或梭化纤维素膜制成。金标抗体纤维层用吸附氯霉素药物的金标抗体玻璃棉，氯霉素药物金标抗体为胶体金标记氯霉素药物的单克隆抗体或多克隆抗体，偶联氯霉素药物的载体蛋白溶液为氯霉素药物与载体蛋白偶联的复合溶液。在测试端吸附纤维层、金标抗体纤维层及吸水材料层上覆盖有保护膜，在测试端纤维层与金标抗体纤维层交界处对应的保护膜上印制有样品标记线，该标记线偏向测试端纤维层一侧约0.5cm处。偶联氯霉素药物的载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），或为鸡卵清白蛋白（OVA），或为铁蛋白，或为血蓝蛋白。本专利技术的氯霉素药物残留快速检测试纸条具有以下优点:(1)特异性强，敏感性高。该试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，快速检测试纸条具有较高的特异性和敏感性。(2)操作简便、快速。使用本专利技术试纸条时无需任何其它试剂，只需滴加100μl左右待检样品于样品垫上，在5分钟内即可判定检测结果。(3)结果显示形象、直观、准确。本测试纸条以显示红棕色“I”及“Ⅱ”印迹作为检测的阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条棕红色“l”印迹表示在被检测样品液中含有氯霉素，两条棕红色“Ⅱ”印迹表示在被检样品中不含氯霉素，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。(4)成本低，投资少。使用快速检测试纸条，不需另配仪器设备及其它试剂，随时随地进行检测，费用低廉，可节省大量贵重仪器及设备费用。(5)应用范围广，便于推广应用。本专利技术快速检测试纸操作简单，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。附图说明图1为氯霉素药物残留快速检测试纸条结构示意图（其中1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6.质控线；7、底板）。图2为氯霉素药物残留快速检测试纸条俯视结构示意图（其中8-1和8-2是覆盖在试纸卡两端的保护膜，9为标记线）。图3为氯霉素药物快速检测试纸卡阴性（图3.a）、阳性（图3.b），无效（图3.c）显色示意图，其中T质控区，C为检测区。具体实施方式制备氯霉素药物残留快速检测试纸条，首先需制备偶联氯霉素药物的载体蛋白和金标抗体，从而制备检测印迹和金标抗体纤维;其次需制备羊抗或兔抗小鼠IgG抗体，用于制备对照印迹。1.氯霉素药物与载体蛋白的偶联分别采用混合酸酐法和碳化二亚胺法将氯霉素药物和卵清蛋白和血蓝蛋白偶联得到包被原（用于固定在反应膜上）和免疫原（用于制备单克隆抗体）。(1)包被原的制备：①将5mg氯霉素药物0.5mL甲酰胺（DMF）溶解，冷却至10℃,加入氯甲酸异丁酯5μ1,4℃搅拌反应30min，即可得到反应液Ⅰ液;②称取卵清蛋白（OVA）30mg，使之充分溶解在2mL50mM碳酸钠溶液中，即可得到反应液Ⅱ液;其中氯霉素药物半抗原与所述卵清蛋白的摩尔配比为（15-20）:1。③将反应Ⅰ液逐滴缓慢滴加到该反应Ⅱ溶液中，4℃反应4h，4℃过夜。取最终反应物于pH7.4，0.02M磷酸盐缓冲液中透析纯化24h，3000g以上离心30min，收集上清液，即得到包被原。(2)免疫原的制备：①将5mg氯霉素药物、10mgN-羟基琥珀酰亚胺（NHS），以及12.5mg碳化二亚胺（EDC）充分溶解于1mLDMF中，于室温下搅拌24h，即可得到反应液Ⅰ液;②称取血蓝蛋白40mg，使之充分溶解在3mL40mM碳酸钠溶液中，即得到反应液Ⅱ液，其中氯霉素药物半抗原与所述血蓝蛋白的摩尔配比为（12-15）:1。③将反应液Ⅰ液逐滴缓慢滴加到反应液Ⅱ液中，并于室温下搅拌3h，然后4℃过夜，过柱，用缓冲液平衡和洗脱，进一步纯化后得到免疫原。2.抗氯霉素药物单克隆抗体的制备(1)动物免疫：将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生抗血清。(2)细胞融合和克隆化：小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7：1比例(数量配比)与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。(3)细胞冻存和复苏：将前述单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1X106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。(4)单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5mL/只，7天后腹腔注射氯霉素药物的单克隆杂交瘤细胞株5X107个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，得到单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氯霉素药物残留快速检测试纸条，含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，其特征是:吸附层从测试端依次为纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联氯霉素药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，有用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“Ⅱ”。

【技术特征摘要】
1.一种氯霉素药物残留快速检测试纸条，含有底层为支撑层，中间层吸附层固定在支撑层上，外层保护层固定在吸附层上，其特征是:吸附层从测试端依次为纤维层、吸附金标抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，其中在纤维素膜层上有用偶联氯霉素药物的载体蛋白溶液印制的直线式检测印迹，有用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直线式对照印迹，检测印迹和对照印迹平行组合排列为“Ⅱ”。2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：支撑层是用不吸水的硬质塑胶条或硬纸条制成。3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：测试端纤维层用玻璃棉、或尼龙膜、或聚偏二氟乙烯膜、或聚酯膜制成。4.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：吸水材料层用吸水纸制成。5.根据权利要求1所述的试纸条，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪霞，立雯馨，秦悦，
申请(专利权)人：镇江亿特生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32