一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，包括A液和B液，所述A液为样品处理液，B液为量子点荧光探针，样品处理液的成分为碱溶液；本发明专利技术同时公开了所述真菌量子点荧光免疫检测试剂盒的制备方法及使用方法；本发明专利技术中采用量子点偶联葡聚糖多克隆抗体代替CFW染色剂，实现了对真菌的特异性检测，荧光探针采用葡聚糖高亲和抗体制备，避免了因CFW特异性结合能力差引起的假阳性或假阴性，大大提高了真菌检出率、准确率；量子点具有激发光谱宽、发射光谱窄的特点，可见光可激发使其发出荧光，可实现在光学显微镜直接镜检，无需加装荧光模块或使用荧光显微镜，降低了对检测人员技术及实验室检测仪器的要求。

A kit for fluorescence immunoassay of fungal quantum dots

【技术实现步骤摘要】
一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒
本专利技术涉及医学生物领域，具体是一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒。
技术介绍
自然界使人类致病的微生物主要有：细菌、真菌、病毒、寄生虫四大类。真菌是自然界的一大类真核生物，分布广、种类多，其中500余种可对人类致病；近年来，随着我国老龄化的到来，恶性肿瘤的高发、艾滋病的流行、化疗药物、广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂等药物在临床的广泛使用，以及人工导管等侵入性操作技术，器官移植等有创诊疗技术的应用，使得真菌病的发生在临床上越来越多。并且真菌病常常涉及多个科室，临床表现复杂，真菌病感染顽固难愈，易导致误诊误治，因此临床工作中加强真菌病的检测越显重要。目前临床常用的真菌检测方法有KOH湿片法，革兰氏染色法，真菌分离培养法，PCR法、荧光检测法等。其中KOH湿片法操作简单，常有各种杂质导致视野背景较杂乱，非常依赖检测人员的经验与技术水平但灵敏度、特异性及准确率低；革兰氏染色法操作较为复杂，结果不准确，无法确认是否为真菌感染；真菌分离培养法特异度高，能分辨均属，但取材要求高，培养要求高，检测周期长，有假阴性；PCR法耗时长，需要较高的实验室条件，无法推广普及。荧光检测法是一种应用很多年的检测方法，可快速有限提高真菌的诊断水平。目前常用的荧光试剂为CalfluorWhite（CFW）,其能与真菌结合，在紫外的激发下发生荧光，CFW一般需要联合复染剂使用。但CFW特异性结合能力较差，淬灭时间短，同时也能使背景组织发出明亮的荧光，影响真菌与背景的判断。因此，有必要提供一种高特异性、高灵敏度的真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，以解决现有技术中的不足。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：真菌细胞壁中富含β-葡聚糖，因此可将经蛋白修饰的β-葡聚糖与真菌提取物作为免疫原制备兔多抗，并对高效价且交叉反应弱的抗体进行纯化，纯化后的抗体与量子点进行标记制备高亲和力荧光探针，直接对体液样本进行检测。一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，包括A液和B液，所述A液为样品处理液，B液为量子点荧光探针，样品处理液的成分为碱溶液；一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：（1）葡聚糖多克隆抗体制备（1.1）免疫原制备：使用过碘酸盐氧化法对β-葡聚糖进行BSA/OVA修饰；（1.2）动物免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后对新西兰兔进行皮下多点注射，再次免疫改用弗氏不完全佐剂；第三次免疫后，每隔一周取耳动脉血测定抗血清效价，当免疫效价不再升高时，颈动脉放血，分离抗血清；（1.3）间接ELISA法测定抗血清效价:用碳酸盐缓冲液稀释抗原至5~10ug/ml作为包被液，4℃包被过夜后弃去；洗脱液洗涤三次，封闭液37℃封闭1h后弃去，用磷酸盐缓冲液梯度稀释抗血清/多克隆抗体后加到酶标板上，37℃孵育1h，洗板后加入HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，洗板后加入TMB显色液，37℃显色15min后终止；测定450nm吸光度值，将吸光度值为0.3的抗血清/多克隆的稀释倍数作为其效价；（1.4）多克隆抗体的获得：抗血清献一次用50%和33%饱和硫酸铵盐析，再用琼脂糖凝胶ProteinA亲和层析，获得高纯度的多克隆抗体，最后用十二烷基苯磺酸钠-聚苯稀酰胺凝胶电泳进行鉴定。（2）量子点荧光探针的制备采用EDC偶联法标记抗体，将量子点溶液和EDC溶液按照按1:10比例混合，并常温避光活化；然后加入过量待标记抗体，调整反应pH值为6，避光反应1h；将反应结束的液体进行超滤，在10000rpm下离心20min，吸出超滤后的标记抗体，用含20mMTris、15%蔗糖、1%BSA，pH7.5的溶液复溶至原体积，即为制备好的量子点标记抗体；（3）样本处理液的配制：配制一定量浓度为0.01mol/L的氢氧化钾水溶液；（4）液体分装。作为本专利技术进一步的方案：一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：（1）葡聚糖多克隆抗体制备（1.1）免疫原制备：使用过碘酸盐氧化法对β-葡聚糖进行BSA/OVA修饰；（1.2）动物免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后对新西兰兔进行皮下多点注射，再次免疫改用弗氏不完全佐剂；第三次免疫后，每隔一周取耳动脉血测定抗血清效价，当免疫效价不再升高时，颈动脉放血，分离抗血清；（1.3）间接ELISA法测定抗血清效价:用碳酸盐缓冲液稀释抗原至6-9ug/ml作为包被液，4℃包被过夜后弃去；洗脱液洗涤三次，封闭液37℃封闭1h后弃去，用磷酸盐缓冲液梯度稀释抗血清/多克隆抗体后加到酶标板上，37℃孵育1h，洗板后加入HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，洗板后加入TMB显色液，37℃显色15min后终止；测定450nm吸光度值，将吸光度值为0.35的抗血清/多克隆的稀释倍数作为其效价；（1.4）多克隆抗体的获得：抗血清献一次用50%和33%饱和硫酸铵盐析，再用琼脂糖凝胶ProteinA亲和层析，获得高纯度的多克隆抗体，最后用十二烷基苯磺酸钠-聚苯稀酰胺凝胶电泳进行鉴定。（2）量子点荧光探针的制备采用EDC偶联法标记抗体，将量子点溶液和EDC溶液按照按3:20比例混合，并常温避光活化；然后加入过量待标记抗体，调整反应pH值为7，避光反应1h；将反应结束的液体进行超滤，在10000rpm下离心20min，吸出超滤后的标记抗体，用含20mMTris、15%蔗糖、1%BSA，pH8.0的溶液复溶至原体积，即为制备好的量子点标记抗体；（3）样本处理液的配制：配制一定量浓度为0.01mol/L的氢氧化钾水溶液；（4）液体分装。作为本专利技术进一步的方案：一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：（1）葡聚糖多克隆抗体制备（1.1）免疫原制备：使用过碘酸盐氧化法对β-葡聚糖进行BSA/OVA修饰；（1.2）动物免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后对新西兰兔进行皮下多点注射，再次免疫改用弗氏不完全佐剂；第三次免疫后，每隔一周取耳动脉血测定抗血清效价，当免疫效价不再升高时，颈动脉放血，分离抗血清；（1.3）间接ELISA法测定抗血清效价:用碳酸盐缓冲液稀释抗原至7-8ug/ml作为包被液，4℃包被过夜后弃去；洗脱液洗涤三次，封闭液37℃封闭1h后弃去，用磷酸盐缓冲液梯度稀释抗血清/多克隆抗体后加到酶标板上，37℃孵育1h，洗板后加入HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，洗板后加入TMB显色液，37℃显色15min后终止；测定450nm吸光度值，将吸光度值为0.4的抗血清/多克隆的稀释倍数作为其效价；（1.4）多克隆抗体的获得：抗血清献一次用50%和33%饱和硫酸铵盐析，再用琼脂糖凝胶ProteinA亲和层析，获得高纯度的多克隆抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，包括A液和B液，其特征在于，所述A液为样品处理液，B液为量子点荧光探针，样品处理液的成分为碱溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，包括A液和B液，其特征在于，所述A液为样品处理液，B液为量子点荧光探针，样品处理液的成分为碱溶液。


2.根据权利要求1所述真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，其特征在于，按照如下步骤进行制备：
（1）葡聚糖多克隆抗体制备
（1.1）免疫原制备：使用过碘酸盐氧化法对β-葡聚糖进行BSA/OVA修饰；
（1.2）动物免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后对新西兰兔进行皮下多点注射，再次免疫改用弗氏不完全佐剂；第三次免疫后，每隔一周取耳动脉血测定抗血清效价，当免疫效价不再升高时，颈动脉放血，分离抗血清；
（1.3）间接ELISA法测定抗血清效价:用碳酸盐缓冲液稀释抗原至5~10ug/ml作为包被液，4℃包被过夜后弃去；洗脱液洗涤三次，封闭液37℃封闭1h后弃去，用磷酸盐缓冲液梯度稀释抗血清/多克隆抗体后加到酶标板上，37℃孵育1h，洗板后加入HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，洗板后加入TMB显色液，37℃显色15min后终止；测定450nm吸光度值，将吸光度值为0.3的抗血清/多克隆的稀释倍数作为其效价；
（1.4）多克隆抗体的获得：抗血清献一次用50%和33%饱和硫酸铵盐析，再用琼脂糖凝胶ProteinA亲和层析，获得高纯度的多克隆抗体，最后用十二烷基苯磺酸钠-聚苯稀酰胺凝胶电泳进行鉴定。
（2）量子点荧光探针的制备
采用EDC偶联法标记抗体，将量子点溶液和EDC溶液按照按1:10比例混合，并常温避光活化；然后加入过量待标记抗体，调整反应pH值为6，避光反应1h；将反应结束的液体进行超滤，在10000rpm下离心20min，吸出超滤后的标记抗体，用含20mMTris、15%蔗糖、1%BSA，pH7.5的溶液复溶至原体积，即为制备好的量子点标记抗体；
（3）样本处理液的配制：配制一定量浓度为0.01mol/L的氢氧化钾水溶液；
（4）液体分装。


3.根据权利要求2所述真菌量子点荧光免疫检测试剂盒，其特征在于，按照如下步骤进行制备：
（1）葡聚糖多克隆抗体制备
（1.1）免疫原制备：使用过碘酸盐氧化法对β-葡聚糖进行BSA/OVA修饰；
（1.2）动物免疫：将免疫原与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化后对新西兰兔进行皮下多点注射，再次免疫改用弗氏不完全佐剂；第三次免疫后，每隔一周取耳动脉血测定抗血清效价，当免疫效价不再升高时，颈动脉放血，分离抗血清；
（1.3）间接ELISA法测定抗血清效价:用碳酸盐缓冲液稀释抗原至6-9ug/ml作为包被液，4℃包被过夜后弃去；洗脱液洗涤三次，封闭液37℃封闭1h后弃去，用磷酸盐缓冲液梯度稀释抗血清/多克隆抗体后加到酶标板上，37℃孵育1h，洗板后加入HRP标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，洗板后加入TMB显色液，37℃显色15min后终止；测定450nm吸光度值，将吸光度值为0.35的抗血清/多克隆的稀释倍数作为其效价；
（1...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚丛丛，王振亚，
申请(专利权)人：济南德亨医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37