捕获筛及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种捕获筛，包括筛网骨架和设置于所述筛网骨架上的捕获物，所述捕获物能够与目标细胞或生物分子特异性结合，所述筛网骨架具有金属原子，所述的筛网骨架和所述捕获物之间通过巯基化物质连接，其中巯基化物质与所述筛网骨架通过反应形成金属‑硫键而结合，巯基化物质与所述捕获物通过反应形成酰胺键而结合；所述巯基化物质为巯基化海藻酸钠和巯基化透明质酸中的一种或两种的组合。本发明专利技术的捕获筛在筛网骨架表面通过金属‑硫键连接有巯基化物质，并通过在巯基化物质与捕获物之间形成酰胺键，实现将捕获物通过巯基化物质连接至筛网骨架上，且采用了巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸，在保证了较高的捕获效率的前提下，后续很方便的将捕获的物质洗脱。

Capture screen and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
捕获筛及其制备方法
本专利技术属于医疗器械
，具体涉及一种通过巯基化物质连接捕获物的捕获筛以及该捕获筛的制备方法。
技术介绍
微流控芯片技术是把生物学、化学等实验室的基本操作过程集成到一块芯片上，具有集成性、高通量、检测快速、操作便利、所需样本量少、低耗能优点，近年来在药物研究等众多科研与生活领域拥有越来越多的广阔应用前景。用于芯片上细胞分离和捕获的手段涉及光、电、声、磁、流体力学、机械加工以及化学方法等众多领域。微机械加工技术结合流体力学控制用于整体及单个细胞、细菌样本的捕获是目前最有效的固定方式。这种技术往往通过加工尺寸与细胞相匹配的微井、微孔、微坝、微狭缝及微管道等几何陷阱或障碍来捕获细胞，不仅可形成开放阵列体系，还可以在微通道中实现对细胞的控制。随着微加工技术的不断进步，微流控芯片在生物分析中的优势愈显突出，在疾病诊断、药物筛选和细胞分子生物学研究等多个领域里显示出巨大的发展潜力和应用价值。在生物分析领域，捕获筛所采用的高分子聚合物主要有二甲基硅氧烷（PDMS）和聚乙烯（PC）等，其中PDMS因具有良好的生物相容性、光透性和易加工制作等特点，成为最常用的材料之一。然而，现有的捕获筛对生物样本中的蛋白质等生物大分子、细菌和细胞等物质易发生非特异性吸附，影响芯片的生物分析效能。且聚合物表面能量低，缺乏功能化反应所需要的活性基团，捕获效率较低。本申请人于2018年提出了一种用于捕获生物分子、细胞或细菌的捕获筛，参见CN109609336A，该捕获筛包括基体层、形成于所述基体层上的保护层及形成于所述保护层上的高分子层，所述高分子层的原料包括：聚乙烯醇和/或聚乙二醇；透明质酸；羟乙基纤维素；琼脂糖和/或葡聚糖等。该捕获筛通过在保护层表面覆着上高分子聚合物涂层，引入聚乙二醇和/或聚乙烯醇、透明质酸、羟乙基纤维素、聚乳酸、聚酰胺、琼脂糖和/或葡聚糖等进行聚合，活化材料表面，使得高分子材料膜具有很好的亲水性提高了目标分子的捕获效率。然而，该捕获筛的结构和制备工艺较为复杂。另一方面，现有的捕获筛在进行特定细胞捕获之后，特定细胞的洗脱较为复杂或者洗脱率较低，对后续细胞的处理影响较大。
技术实现思路
本申请所要解决的技术问题是，提供一种改进的捕获筛，其不仅具有高的捕获效率，而且结构和制备工艺较为简单，且在捕获后能够方便地将捕获的细胞洗脱。本申请同时提供一种捕获筛的制备方法，其工艺简单且制备得到的捕获筛具有高的捕获效率以及高的洗脱效率。有鉴于此，为了克服上述缺陷以及达到上述目的，本专利技术采用以下的技术方案：一种捕获筛，包括筛网骨架和设置于所述筛网骨架上的捕获物，所述捕获物能够与目标细胞或生物分子特异性结合，所述筛网骨架具有金属原子，所述的筛网骨架和所述捕获物之间通过巯基化物质连接，其中巯基化物质与所述筛网骨架通过反应形成金属-硫键而结合，巯基化物质与所述捕获物通过反应形成酰胺键而结合；所述巯基化物质为巯基化海藻酸钠和巯基化透明质酸中的一种或两种的组合。根据本专利技术的一些优选的实施方面，所述捕获物上具有氨基，所述巯基化物质上具有羧基，所述捕获物与所述巯基化物质通过氨基和羧基反应形成酰胺键而结合。根据本专利技术的一些优选的实施方面，所述巯基化物质的巯基化率为20~30%，即海藻酸钠或透明质酸中羧基总量的20~30%变成了巯基。巯基化率过低，巯基化物质与筛网骨架之间的结合不够牢固；巯基化率过高，巯基化物质可捕获的捕获物相对比例减少，使得后续制备的捕获筛的捕获率降低。在一些实施例中，所述巯基化物质的巯基化率优选为25~30%。根据本专利技术的一些优选的实施方面，所述巯基化物质的分子量为5kDa~35kDa。巯基化物质分子量过大，进行过滤或者透析时容易堵塞，同时分子链过长蜷曲，会使得巯基化物质在金属表面的连接效果降低，影响捕获率。在一些实施例中，所述巯基化物质的分子量为6kDa~34kDa。优选地，所述巯基化物质的巯基化率为25~30%，所述巯基化物质的分子量为6kDa~34kDa。根据本专利技术申请的优选实施例，最优选巯基化物质的巯基化率为26%，巯基化物质的分子量为6~34kDa。根据本专利技术的一些优选的实施方面，所述金属原子为金原子，所述金属-硫键为金-硫键。根据本专利技术的一些优选的实施方面，所述捕获物为上皮细胞粘附分子（EPCAM）抗体，制备得到的所述捕获筛用于捕获循环肿瘤细胞。根据本专利技术的一些优选的实施方面，所述巯基化物质是由海藻酸钠和/或透明质酸与含有氨基的二硫代化合物在羧基活化剂的存在下反应后的产物经二硫键还原剂还原后得到。根据本专利技术的一些优选的实施方面，所述海藻酸钠和/或透明质酸的分子量为5kDa~40kDa，所述的含有氨基的二硫代化合物为3,3'-二硫代二(丙酸肼)，所述羧基活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，所述二硫键还原剂为三(2-羰基乙基)磷盐酸盐。即所述巯基化海藻酸钠通过如下步骤制得：将海藻酸钠和3,3'-二硫代二(丙酸肼)溶解于缓冲液中；先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应后，继续加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐反应，得到巯基化海藻酸钠；所述巯基化透明质酸通过如下步骤制得：将透明质酸和3,3'-二硫代二(丙酸肼)溶解于缓冲液中；先加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺反应后，继续加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐反应，得到巯基化透明质酸。其中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的作用是用于活化海藻酸钠或透明质酸上的羧基即羧基活化剂，使其与3,3'-二硫代二（丙酸肼）发生反应；三(2-羰基乙基)磷盐酸盐即二硫键还原剂的作用是为了将连接在海藻酸钠或透明质酸上的3,3'-二硫代二（丙酸肼）中的二硫键打开，以暴露出巯基，方便后续将巯基化海藻酸钠或巯基化透明质酸连接到捕获筛的筛网骨架上。优选地，含有氨基的二硫代化合物即3,3'-二硫代二(丙酸肼)与海藻酸钠和/或透明质酸的摩尔比为3~5：1；所述二硫键还原剂即三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、羧基活化剂即1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与海藻酸钠和/或透明质酸的摩尔比为15~16：1.5~2.5：1。以巯基化海藻酸钠的制备为例，根据本专利技术的一些优选的实施方面，巯基化海藻酸钠的制备方法包括如下步骤：1）将海藻酸钠溶解于缓冲液中，随后加入3,3'-二硫代二（丙酸肼），搅拌至完全溶解；2）加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，保持溶液的pH为2~7，反应5~15h；之后加入三(2-羰基乙基)磷盐酸盐，继续反应10~40h，得到巯基化海藻酸钠；为了进一步保证巯基化海藻酸钠的纯度、去除小分子和杂质，还需要包括步骤3）用滤菌器过滤反应后的巯基化海藻酸钠溶液，并将过滤后的溶液进行透析；透析的目的一方面是为了去除溶液中的小分子和杂质，另一方面是为了保证产品的分子量。为了方便后续的保存、运输，在一些实施例中上述步骤还包括将巯基化海藻酸钠进行冷冻干燥的步骤：4）将透析后得到的巯基化海藻酸钠溶液转移至冷冻干本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种捕获筛，包括筛网骨架和设置于所述筛网骨架上的捕获物，所述捕获物能够与目标细胞或生物分子特异性结合，其特征在于，所述筛网骨架具有金属原子，所述的筛网骨架和所述捕获物之间通过巯基化物质连接，其中巯基化物质与所述筛网骨架通过反应形成金属-硫键而结合，巯基化物质与所述捕获物通过反应形成酰胺键而结合；所述巯基化物质为巯基化海藻酸钠和巯基化透明质酸中的一种或两种的组合。/n

【技术特征摘要】
1.一种捕获筛，包括筛网骨架和设置于所述筛网骨架上的捕获物，所述捕获物能够与目标细胞或生物分子特异性结合，其特征在于，所述筛网骨架具有金属原子，所述的筛网骨架和所述捕获物之间通过巯基化物质连接，其中巯基化物质与所述筛网骨架通过反应形成金属-硫键而结合，巯基化物质与所述捕获物通过反应形成酰胺键而结合；所述巯基化物质为巯基化海藻酸钠和巯基化透明质酸中的一种或两种的组合。


2.根据权利要求1所述的捕获筛，其特征在于，所述捕获物上具有氨基，所述巯基化物质上具有羧基，所述捕获物与所述巯基化物质通过氨基和羧基反应形成酰胺键而结合。


3.根据权利要求1所述的捕获筛，其特征在于，所述巯基化物质的巯基化率为20~30%。


4.根据权利要求3所述的捕获筛，其特征在于，所述巯基化物质的巯基化率为25~30%。


5.根据权利要求1或3所述的捕获筛，其特征在于，所述巯基化物质的分子量为5kDa~35kDa。


6.根据权利要求4所述的捕获筛，其特征在于，所述巯基化物质的分子量为6kDa~34kDa。


7.根据权利要求6所述的捕获筛，其特征在于，所述巯基化物质的巯基化率为25~30%，所述巯基化物质的分子量为6kDa~34kDa。


8.根据权利要求1所述的捕获筛，其特征在于，所述金属原子为金原子，所述金属-硫键为金-硫键。


9.根据权利要求1所述的捕获筛，其特征在于，所述巯基化物质是由海藻酸钠和/或透明质酸与含有氨基的二硫代化合物在羧基活化剂的存在下反应后的产物经二硫键还原剂还原后得到。...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜菁，相鸿坤，杨天成，
申请(专利权)人：上海邦先医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31