弯曲菌多肽、抗体捕获器件及试剂盒制造技术

弯曲菌多肽、抗体捕获器件及试剂盒。本发明专利技术公开一种SEQ ID：1所示弯曲菌多肽的核心序列、含核心序列的弯曲菌多肽、抗体捕获器件、试剂盒及检测方法，属于免疫学技术领域。本发明专利技术的技术方案是克隆表达含有SEQ ID：1核心序列的弯曲菌多肽，通过固相载体及其上含核心序列的多肽捕获样本中的抗体，达到辅助诊断克罗恩病的作用。

【技术实现步骤摘要】
弯曲菌多肽、抗体捕获器件及试剂盒
本专利技术涉及一种弯曲菌多肽的核心序列、包含多肽的抗体捕获器及试剂盒，属于免疫学检测

技术介绍
炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，IBD)是一种自体免疫性肠病，包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)和克罗恩病(Crohn’sdisease，CD)，近10多年来在我国发病率呈逐步增高趋势。IBD的临床表现复杂多样，不仅有消化道症状，还可有肠外表现。由于症状为腹痛、腹泻、便血等非特异性肠炎表现，CD与UC，以及IBD与结核性肠炎等其他肠道慢性疾病很难鉴别诊断。血清学指标有助于鉴别CD与UC，以及IBD与非IBD。IBD的发病机理复杂，其中之一的机制是由于遗传、环境等因素影响，使肠道粘膜的屏障功能障碍，免疫系统对正常肠道存在的抗原产品免疫反应，表现为体内可检测到对肠道微生物抗原及代谢物的抗体。通过对这些抗体的检测，可辅助诊断自体免疫学肠病包括IBD。目前已明确的具有IBD辅助诊断作用的抗微生物抗体包括抗CBirl抗体、抗Fla-X抗体、抗4aFla-2抗体等细菌鞭毛抗体，以及抗荧光假单胞菌I2抗体和抗大肠杆菌外膜孔道蛋白OmpC抗体等。由于微生物基因的易变异性和多态性，新的微生物抗原不断出现，其中一些参与肠道粘膜的免疫调节。本专利技术所公布的弯曲菌多肽与现有报道的IBD相关抗原多肽差异显著，但经过序列分析，发现与弯曲菌多肽自身抗体产生有关的是某些核心序列，含有该核心序列的弯曲菌多肽经临床确诊的患者样本验证，具有鉴别健康人与克罗恩病的能力。
技术实现思路
本专利技术的第一方面，公布SEQID：1所示的弯曲菌多肽及核心序列，连接核心序列之间的氨基酸序列可有多种变异。所述多肽包含三个核心序列，如SEQID：2和SEQID：3所示。本专利技术的第二方面，提供一种抗体捕获器件的制备方法，把所述的弯曲菌多肽直接或间接固定在固相载体上，用于捕获样本中的抗弯曲菌抗体。固相载体包括微孔板、荧光微球、乳胶微球、树脂微球、磁性微球、薄膜、微孔膜、硝酸纤维素膜等。一个优选例中，固相载体为微孔板，另一个优选例中为磁性微球，第3个优选例中同时选了荧光微球和硝酸纤维膜，第4个优选例中为胶体金。多肽固定在固相载体的方法是直接包被或通过载体蛋白间接包被，优选地，载体蛋白为BSA，或者生物素-链酶亲和素。一个优选例中，把所述多肽与BSA偶联，然后再包被在固相载体上。另一个优选例中，先把多肽与生物素反应，然后把生物素化的多肽与链霉亲和素偶联，形成多肽与链亲合素的复合物，再把复合物包被在固相载体上。本专利技术的第三方面，公开前述的抗体捕获器件在克罗恩病中的应用，本专利技术所述的应用是基于免疫学反应，对样本中抗弯曲菌抗体的测定方法，包括如下步骤：(1)待检测样本作用于抗体捕获器件，使样本中的抗弯曲菌抗体与抗体捕获器件上的多肽结合；(2)通过标记物测定样品中抗弯曲菌多肽抗体的含量。弯曲菌抗原或抗原表位偶联物可通过目前任何一种免疫学检测方法检测样本中的抗弯曲菌抗体，比如ELISA、板式化学发光、化学发光、免疫层析、免疫渗滤等等，所对应的标记物分别为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯、稀土元素和胶体金等。实施例4提供两种抗弯曲菌抗体的酶促板式试剂盒及检测方法，弯曲菌多肽包被在微孔板上，与样本中的抗体反应形成抗原-抗体复合物，把抗人IgG和IgA酶标记，所用的酶为辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，所用的样本为粪便和尿液。实施例5提供一种吖啶酯标记的化学发光试剂盒及检测方法，所述弯曲菌多肽生物素化后通过与链亲合素包被在磁性微球上，与血浆样本中的待检抗体反应形成抗原抗体复合物，清洗后用吖啶酯标记的抗人抗体对抗原抗体复合物进行定量检测。该检测方法具有灵敏度高、检测时间短、全自动检测等优点。实施例6提供一种抗弯曲菌多肽抗体的荧光免疫层析试剂盒及方法，所述方法是把弯曲菌多肽直接或通过生物素-链亲合素包被到含稀土元素的荧光微球上，同时把多肽包被到检测线T线上，形成双抗原夹心法检测血清样本中的抗弯曲菌抗体含量。该检测方法具有快速、检测时间短、灵敏度高等优点。实施例7提供一种抗弯曲菌多肽抗体的胶体金试剂及方法，所述方法是把弯曲菌多肽用胶体金颗粒或彩色乳胶微球标记，喷在样品垫上，同时把多肽包被在检测线T线上，形成双抗原夹心法检测全血样本中抗弯曲菌多肽抗体。该检测方法可肉眼观察结果，具有快捷、仪器成本小等优点。与现有技术相比，本专利技术提供的弯曲菌多肽及抗体捕获器件，用于克罗恩病时，具有灵敏度高、性能稳定、操作简单等优点。附图说明图1化学发光定量检测标准曲线图2化学发光定量检测的特异性与灵敏度图3荧光免疫层析试剂标准曲线具体实施方式本专利技术所用的生物素、羊抗人IgG、羊抗人IgA购自Sigma。亲和素购自盘古基因。磁性微球及预包被有链霉亲和素的磁性微球购自南京迪格诺斯。微孔板购自苏州海狸。乳胶微球、彩色乳胶微球、树脂微球购自天津赛尔群。稀土元素荧光微球及时间分辨荧光阅读器购自深圳微测。其他试剂购自国药试剂和上海生工。下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本专利技术。实施例1弯曲菌多肽的制备1、SEQID：2和SEQID：3多肽制备SEQID：2和SEQID：3全基因组序列由金唯智合成。1)试剂克隆载体pCR2.1T-vector，表达质粒pET28a(+)，转染大肠杆菌宿主菌DH5α、BL21(DE3)，DNA聚合酶rTaq，T4DNA连接酶，DNA聚合酶rTaq、LATaq以及限制性内切酶BamHI、HindIII和EcoRI、BamHI，DL2000DNAMarker、T4DNA连接酶，低分子量标准蛋白，DNA胶回收试剂盒，IPTG等2)仪器普通摇床SCS-24；隔水式恒温电热培养箱；Biophotometer分光光度计、台式冷冻离心机Centrifuge5810R、台式离心机MiniSpin；高速冷冻离心机；蛋白质电泳仪以及凝胶成像系统；PCR仪；超声裂解仪；恒温金属浴；HIS蛋白纯化柱等。2.实验方法1)载体构建：设计引物，从模板DNA中PCR扩增出SEQID：2和SEQID：3片段，胶回收试剂盒回收片段后连接到pCR2.1克隆载体进行测序鉴定。将鉴定正确的序列克隆至表达载体pET28a(+)中，酶切位点为EcoRI、BamHI，同时载体上有6×HIS标签，便于后续的蛋白纯化。2)表达将得到的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，通过抗性筛选阳性表达菌株。将筛选出来的阳性菌液按1∶1000的比例接种加有Kan抗性的LB培养基中，每个菌接种两管，一管用于诱导，另一管用于非诱导对照，同时要接种一管空质粒菌作对照。37℃过夜培养至OD600值约为0.4-0.6时，诱导管和空质粒对照管加入IPTG至终浓度为1mmol/L，非诱导对照不加，最终选择表达能力高的两个菌，用于大量的蛋白的表达。并按照常规的SDS-PAGE方法对表达产物进行鉴定。3)纯化将表达的产物用HIS蛋白纯化柱纯化蛋白，并透析脱盐，纯化后的SEQID：2和SEQID：3低温保存备用。实施例2制备抗弯曲菌多肽抗体1.动物免疫分别用SEQID：2和SEQID：3免疫小鼠，免疫剂量为50μg/只。产生阳性血清后，加强免疫一次后进行细胞融合。如需要制备多克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SEQ ID：1所示弯曲菌多肽，其特征在于，包含3个核心序列及连接序列xxx。

【技术特征摘要】
1.一种SEQID：1所示弯曲菌多肽，其特征在于，包含3个核心序列及连接序列xxx。2.权利要求1所述的弯曲菌多肽，其特征在于，连接序列xxx可变异，优选地，为SEQID：2或SEQID：3多肽。3.一种抗体捕获器件，其特征在于，固相载体及其上包被的权利要求1～2所述的弯曲菌多肽。4.权利要求3所述的固相载体，其特征在于，包括但不限于荧光微球、乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金颗粒、微孔板、薄膜、...

【专利技术属性】
技术研发人员：李振军，陈菲，
申请(专利权)人：苏州和锐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32