一种基于荧光金纳米簇的免标记荧光酶联免疫分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光金纳米簇的免标记荧光酶联免疫分析方法。所述分析方法以蛋白包裹的荧光金纳米簇作为荧光信号探针，是酶标抗原上的葡萄糖氧化酶催化底物葡萄糖产生过氧化氢使体系中荧光金纳米簇的荧光猝灭，利用目标物和酶标抗原竞争结合在微孔板上的抗体，从而使体系的荧光发射光谱发生变化，可用于灵敏定量检测目标物分子。本发明专利技术所采用的荧光金纳米簇对葡萄糖氧化酶响应灵敏，同时免标记技术使荧光金纳米簇在本体系应用中的可控性、稳定性得到大大提高。本方法所构建的体系具有操作简便、灵敏度高、稳定性好、成本低廉等优点，可应用于灵敏定量检测动物饲料中的喹乙醇残留。

A label-free fluorescent enzyme-linked immunoassay method based on fluorescent gold nanoclusters

The invention discloses a label-free fluorescent enzyme-linked immunoassay method based on fluorescent gold nanoclusters. The analysis method uses protein-coated fluorescent gold nanoclusters as fluorescence signal probes, which are hydrogen peroxide catalyzed by glucose oxidase on enzyme-labeled antigen to quench fluorescence of fluorescent gold nanoclusters in the system, and competitive binding of antibodies on the microporous plate by target and enzyme-labeled antigen to change fluorescence emission spectra of the system, which can be used for sensitive quantitative analysis. Detection of target molecule. The fluorescent gold nanoclusters used in the invention are sensitive to the response of glucose oxidase, and the label-free technology greatly improves the controllability and stability of the fluorescent gold nanoclusters in the application of the system. The system constructed by this method has the advantages of simple operation, high sensitivity, good stability and low cost. It can be used for the sensitive quantitative detection of olaquindox residues in animal feed.

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光金纳米簇的免标记荧光酶联免疫分析方法
本专利技术涉及一种基于荧光金纳米簇的免标记荧光酶联免疫分析方法，属于纳米生物传感以及食品安全兽药检测领域。
技术介绍
荧光金纳米簇是以金属为核、有机配体为壳的粒径为0.2～3nm的核壳型结构，由于其粒径接近于电子的费米波长，性质介于单原子和较大的纳米粒子之间，呈现良好的光学性质，如发光性能好、光稳定性高、斯托克斯位移大、荧光量子产率高等，合成方法简便且绿色无污染。荧光金纳米簇作为一种新型的荧光纳米材料成为研究热点，而且已被广泛应用于催化、生物医药、生物检测等领域。但是在免疫分析检测中，因为其粒径小，和生物识别材料偶联后不易纯化，所以很难将其作为荧光标记物用于免疫分析检测中。根据文献报道，葡萄糖氧化酶是一种稳定性高、催化效率好、成本低廉的常用酶，它可以催化葡萄糖产生过氧化氢，再加入亚铁离子后发生芬顿反应产生大量羟基自由基，可以有效地猝灭荧光金纳米簇的荧光。喹乙醇属于喹噁啉类化合物，因为它具有提高饲料转化效率、加速动物生长和防止动物细菌疾病等功能，常以饲料添加或口服形式被用于动物养殖业中。喹乙醇在动物体内以原形或代谢物形式残留或经粪尿、饲料等形式排入生态环境，对生物和水体造成污染，进而通过食物链传递对人类健康产生潜在危害。鉴于此，欧盟于1998年禁止喹乙醇使用。但因为经济利益的驱使且上级缺乏有效的检测体系，目前养殖业仍存在喹乙醇的非法使用现象。为此国内外研究者相继建立了一些检测喹乙醇的技术方法，如色谱技术、酶联免疫吸附法、免疫层析法等。但是这些方法都存在一些不可避免的缺点，所以建立一种检测喹乙醇的新方法实现对该药物的超灵敏定量检测有助于监控其在动物养殖业中的使用，为我国的生态环境和动物性食品安全保驾护航。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于荧光金纳米簇的免标记荧光酶联免疫分析方法，本专利技术采用荧光金纳米簇作为一种新型的荧光纳米材料应用于免疫分析检测中，提高了分析方法的灵敏度、可控性和稳定性。本专利技术提供的基于荧光金纳米簇的免标记荧光酶联免疫分析方法，包括如下步骤：制备荧光金纳米簇；合成葡萄糖氧化酶-目标物分子复合物作为酶标抗原；构建荧光酶联免疫分析体系。具体地，所述免标记荧光酶联免疫分析方法包括如下步骤：(1)向培养板中加入包被原进行包被，再加入目标物分子的单克隆抗体进行反应，然后加入封闭液进行封闭处理；(2)分别向所述培养板中加入葡萄糖氧化酶-目标物分子复合物和所述目标物分子的标准溶液进行反应；(3)向所述培养板中加入葡萄糖溶液进行反应；(4)向所述培养板中加入荧光金纳米簇和硫酸亚铁溶液进行反应；(5)测定所述培养板中的混合液在365nm激发波长下，650nm波长处的荧光强度；根据所述目标物分子的标准溶液的浓度与其荧光强度的变化值，制作标准曲线；(6)分别向所述培养板中加入所述葡萄糖氧化酶-目标物分子复合物和待测样品的提取液进行反应；重复步骤(3)-(5)，得到在365nm激发波长下，650nm波长处的荧光强度变化值，再根据所述标准曲线，即得到所述待测样品的提取液中所述目标物分子的浓度。上述的免标记荧光酶联免疫分析方法中，步骤(1)中，采用碳酸盐缓冲液(0.01M、pH9.6)稀释所述包被原至浓度可为20μg/ml，可在4℃包被过夜；所述包被原可为ProteinA。上述的免标记荧光酶联免疫分析方法中，所述目标物分子可为喹噁啉类药物；所述喹噁啉类药物具体可为喹乙醇；所述待测样品可为饲料或肉制品，如鱼肉制品、鸡肉制品等。上述的免标记荧光酶联免疫分析方法中，步骤(1)中，所述封闭液可采用牛血清白蛋白溶液，如在37℃封闭1小时。上述的免标记荧光酶联免疫分析方法中，所述葡萄糖氧化酶-目标物分子复合物可为葡萄糖氧化酶-喹乙醇复合物，可按照如下方法制备：所述喹乙醇和琥珀酸酐进行反应，向所述反应后的体系中加入水经冷却出现沉淀物，离心收集沉淀；所述沉淀与碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行反应，然后加入葡萄糖氧化酶的溶液进行反应，即得所述葡萄糖氧化酶-喹乙醇复合物。上述的免标记荧光酶联免疫分析方法中，所述喹乙醇与所述琥珀酸酐可在二甲基亚砜中进行所述反应；如在90℃水浴条件下恒温搅拌反应1小时。上述的免标记荧光酶联免疫分析方法中，所述喹乙醇与所述葡萄糖氧化酶的摩尔比为10～33：1；采用PBS缓冲液(0.01M，pH7.2)配制所述葡萄糖氧化酶的溶液；还包括如下纯化步骤：用3500Da的透析袋，在4℃条件下透析48小时进行纯化处理；加入等体积的甘油后，-20℃保存。上述的免标记荧光酶联免疫分析方法中，所述荧光金纳米簇可为蛋白包裹的荧光金纳米簇；所述蛋白包裹的荧光金纳米簇是按照包括如下步骤的方法制备的：将所述蛋白和氯金酸溶液等体积混合进行反应，然后加入NaOH溶液，继续反应即得；所述蛋白的浓度为50mg/ml，所述氯金酸溶液的质量百分含量为0.5％；所述NaOH溶液的加入量为所述蛋白和所述氯金酸溶液的总体积的1/10；所述蛋白可为牛血清白蛋白。上述的免标记荧光酶联免疫分析方法中，步骤(2)中，所述目标物分子的标准溶液的浓度可为0～200μg/l。上述的免标记荧光酶联免疫分析方法中，步骤(3)中，所述葡萄糖溶液的浓度可为0.8～1.2mg/ml，具体可为1.0mg/ml。上述的免标记荧光酶联免疫分析方法中，步骤(4)中，所述硫酸亚铁溶液的浓度可为450～500μM，具体可为500μM。上述的免标记荧光酶联免疫分析方法中，步骤(5)中，所述荧光强度变化指的是步骤(4)中加入所述硫酸亚铁溶液进行反应前后的荧光变化。本专利技术利用荧光金纳米簇能被葡萄糖氧化酶介导的芬顿反应产生的羟基自由基猝灭的特点，提供了一种基于荧光金纳米簇的免标记荧光酶联免疫分析技术，能够实现简便、灵敏定量检测饲料中的喹乙醇。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术解决了荧光金纳米簇在免疫分析检测中的应用障碍，提高了其在免疫分析检测应用中的可控性和稳定性。本专利技术检测方法具有灵敏度高、稳定性好、操作简便、成本低廉等优点。通过改变生物识别材料，利用葡萄糖氧化酶标签和荧光信号探针，本专利技术检测方法可以推广到喹噁啉类药物甚至其它药物残留的检测中。附图说明图1为本专利技术基于荧光金纳米簇的免标记荧光酶联免疫分析方法的原理示意图。图2为本专利技术实施例1制备的荧光金纳米簇的表征：图2(A)为在紫外灯下的外观图；图2(B)为纳米簇的荧光光谱图。图3为过氧化氢对荧光金纳米簇的影响：图3(A)为加入不同浓度过氧化氢溶液(a至i分别为0，0.05，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，50.0μM)后荧光金纳米簇的荧光光谱变化；图3(B)为检测过氧化氢的定量标准曲线。图4为荧光金纳米簇对葡萄糖氧化酶的响应定量标准曲线。图5为基于荧光金纳米簇的免标记荧光酶联免疫分析方法检测喹乙醇的定量标准曲线。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1：合成牛血清白蛋白包裹的荧光金纳米簇将50mg/ml的牛血清白蛋白和0.5wt％的氯金酸溶液恒温至37℃，两者等体积混合并剧烈搅拌反应2～3分钟后，加入1/10体积的NaOH(1M)溶液，继续在37℃条件下搅本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于荧光金纳米簇的免标记荧光酶联免疫分析方法，包括如下步骤：(1)向培养板中加入包被原进行包被，再加入目标物分子的单克隆抗体进行反应，然后加入封闭液进行封闭处理；(2)分别向所述培养板中加入葡萄糖氧化酶‑目标物分子复合物和所述目标物分子的标准溶液进行反应；(3)向所述培养板中加入葡萄糖溶液进行反应；(4)向所述培养板中加入荧光金纳米簇和硫酸亚铁溶液进行反应；(5)测定所述培养板中的混合液在365nm激发波长下，650nm波长处的荧光强度变化；根据所述目标物分子的标准溶液的浓度与其荧光强度的变化值，制作标准曲线；(6)分别向所述培养板中加入所述葡萄糖氧化酶‑目标物分子复合物和待测样品的提取液进行反应；重复步骤(3)‑(5)，得到在365nm激发波长下，650nm波长处的荧光强度变化值，再根据所述标准曲线，即得到所述待测样品的提取液中所述目标物分子的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光金纳米簇的免标记荧光酶联免疫分析方法，包括如下步骤：(1)向培养板中加入包被原进行包被，再加入目标物分子的单克隆抗体进行反应，然后加入封闭液进行封闭处理；(2)分别向所述培养板中加入葡萄糖氧化酶-目标物分子复合物和所述目标物分子的标准溶液进行反应；(3)向所述培养板中加入葡萄糖溶液进行反应；(4)向所述培养板中加入荧光金纳米簇和硫酸亚铁溶液进行反应；(5)测定所述培养板中的混合液在365nm激发波长下，650nm波长处的荧光强度变化；根据所述目标物分子的标准溶液的浓度与其荧光强度的变化值，制作标准曲线；(6)分别向所述培养板中加入所述葡萄糖氧化酶-目标物分子复合物和待测样品的提取液进行反应；重复步骤(3)-(5)，得到在365nm激发波长下，650nm波长处的荧光强度变化值，再根据所述标准曲线，即得到所述待测样品的提取液中所述目标物分子的浓度。2.根据权利要求1所述的免标记荧光酶联免疫分析方法，其特征在于：所述目标物分子为喹噁啉类药物；所述待测样品为饲料或肉制品。3.根据权利要求2所述的免标记荧光酶联免疫分析方法，其特征在于：所述喹噁啉类药物为喹乙醇。4.根据权利要求3所述的免标记荧光酶联免疫分析方法，其特征在于：所述葡萄糖氧化酶-目标物分子复合物为葡萄糖氧化酶-喹乙醇复合物，按照如下方法制备：所述喹乙醇和琥珀酸酐进行反应，向所述反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：江海洋，彭涛，沈建忠，王战辉，温凯，王见一，史为民，李建成，孙淑娟，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11