一种微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的方法及其在胰腺癌早期诊断中的应用技术

本发明专利技术提供一种微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的试剂盒包括微流控芯片，所述微流控芯片包括基底层和位于基层上的顶层，上下两层相连通；基底层和顶层均设有微流通道和孔，微流通道与孔相连通，底层和顶层通过混合流道相通；基底层和顶层分别设有加样孔、反应孔、检测孔、质控孔、废液排出孔；基底层的反应孔包被半乳糖凝聚物‑1的单克隆抗体或抗GPC1的IgG抗体；所述基底层的加样孔和反应孔喷涂聚乙二醇PEG6000聚合物；基底层的反应孔固化有捕获纳米磁珠，所述磁珠与量子点标记外泌体抗GPC1特异性抗体的偶联。通过与其配套设备的量子点荧光免疫分析系统检测技术相结合，本发明专利技术方法灵敏度高、所需样本量小，检测所用设备成本低、可高通量、特异性高、准确度高。

【技术实现步骤摘要】
一种微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的方法及其在胰腺癌早期诊断中的应用
本专利技术属于医学生物检测技术和体外诊断试剂的领域，具体涉及一种微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的方法及其在胰腺癌早期诊断中的应用。
技术介绍
胰腺癌被称为“癌症之王”，其死亡率高达90％左右，是全球最常见的恶性肿瘤之一。胰腺癌因为没有特异症状，起病隐匿、进展迅速，早期诊断十分困难，容易漏诊和误诊，确诊时通常肿瘤已转移到其他脏器，导致手术成功率和术后5年存活率都很低，仅为3％。无论国内、国外对胰腺癌的研究都明显滞后于其它胃肠道癌症。根据中国国家癌症中心公布的数据，在近10年来，中国胰腺癌发病率和死亡率却在不断升高；《2018年中国癌症统计数据》结果显示，我国2018年胰腺癌的新发病例数为6.74/10万，其中，男性患者7.45/10万人，胰癌死亡患者3.47/10万人，其中包括男性6.64/10万人，女性5.18/10万人。胰腺癌缺乏特异性肿瘤标志物，虽然大部分胰腺癌患者血清CA19-9水平显著升高，但是，也只能用于监测病情和反映预后，由于其特异性欠佳，尤其是与胆系疾病的鉴别诊断困难，且在胰腺癌早期有时正常，因而单独应用CA19-9不能对胰腺癌进行早期诊断。如果仅依靠传统的影像学手段难以实现胰腺癌的早期诊断及大规模的人群筛查。因此，胰腺癌的研究目前是国内外学者关注的焦点和研究的热点，大家迫切寻找敏感、特异的、无创的胰腺癌早期诊断方法，迫切需要一种能够早期诊断胰腺癌及预后监测的检测技术。外泌体参与调控肿瘤等多种疾病，已经成为新的研究热点。外泌体(exosome)存在于人各种体液之中，包括血液、尿液、唾液、乳汁等，包含细胞特异的蛋白、脂质和核酸可以作为疾病诊断的标记。外泌体作为人体内重要的囊泡，直径约为30-200nm，密度在1.13-1.21g/ml，具有杯状形态、双层膜结构，其生物学功能受到越来越多的关注。有研究发现肿瘤来源的外泌体可通过将其遗传信息转移至受体细胞来促进肿瘤生长、侵袭和转移，并抑制免疫反应。鉴于其在肿瘤进展中的功能，外泌体被认为可应用于临床早期检测人类恶性肿瘤的最有前景的生物标志物。肿瘤来源的外泌体是一个异质性的群体，并产生独特的肿瘤微环境。肿瘤是由不同的基因和表型的肿瘤细胞形成的复合物，比如干细胞、基质细胞、成纤维细胞和免疫细胞等等，所有这些细胞分泌的外泌体组成了肿瘤细胞的特殊的微环境，并且形成了细胞与细胞之间的交流，促进肿瘤血管新生和肿瘤转移，以及直接作用于肿瘤细胞等途径，影响肿瘤的进展。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(Glypican-1，简称GPC1)是胰腺肿瘤外泌体的特定标志物，研究发现GPC1在胰腺癌细胞外泌体中大量表达，且外泌体GPC1的含量与肿瘤大小成正比。外泌体GPC1蛋白检测可用于临床癌症诊断和治疗监测，具有重要意义。2015来自美国M.D安德森癌症中心研究者们通过大量的胰腺癌患者血清样本分析发现，相比正常人，胰腺癌患者血清中GPC1阳性的外泌体占比显著增高。进一步研究发现，GPC1阳性外泌体在早期胰腺癌患者的血清中丰度显著高于正常人群，能够以100％的准确性和敏感性诊断早期和晚期胰腺癌，这一发现提示其可作为早期诊断胰腺癌的新检测方法。CN105974122A专利技术专利公开了一种检测外泌体GPC1蛋白的方法，采用外泌体特异性抗体抗CD9抗体、抗CD63抗体、抗CD81抗体和抗Flotillin-1抗体的其中两种免疫磁珠结合与电化学传感器技术检测胰腺癌外泌体GPC1，采用磁珠免疫捕获提取外泌体，虽然特异性较高，方法简便、不影响外泌体形态完整等优点。但是此方法效率低，不适合从大量样本获得外泌体，基质的非特异性吸附会导致获得的外泌体中存在干扰蛋白质，且磁珠、抗体较为昂贵，保存条件苛刻，外泌体的生物活性易受pH值和盐浓度的影响，不利于下游实验，难以普及。CN103344464A专利技术专利公开了一种用于糖基分离的微流控凝集素芯片及其制备方法。该专利技术的主要是以再生的细菌纤维素作为芯片填料，凝集素固定步骤简便，光谱监测方便，糖基分离微生物的糖蛋白。但该专利技术不是应用于提取外泌体和检测外泌体表面上的肿瘤标志物。CN103018437A专利技术专利公开了一种量子点微流控芯片用于单细胞水平膜表面糖基表达分析。该专利技术也不是应用于提取外泌体和检测外泌体表面上的肿瘤标志物。目前，差速离心法被认为是外泌体分离的金标准，但也存在一些缺点。费时费力、高度依赖人工，回收率低，由于重复离心操作很有可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量，并且易聚集成块而产生污染，下游分析不利。目前使用提取和富集外泌体的方法均有局限性，因为每个细胞分泌至少10种不同类型的纳米囊泡，很难或不可能依据相似的大小、密度和表面标记物来区分这些囊泡。因此，目前国内外学者积极探索一种能够快速、高效分离外泌体的实验方法用于胰腺癌的早期诊断。外泌体组成的成分主要有核酸、蛋白质、脂质和糖类物质。外泌体还表达丰富的凝集素，凝集素是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中体纯的糖蛋白。不同来源的凝集素能够识别并结合不同糖型的糖缀合物。半乳糖凝集素能够识别β半乳糖结构的糖蛋白。半乳糖凝集素(Galectin)是凝集素超级家族中的一个家族，广泛分布于各种动物体内。已克隆并命名的成员有15个，结构上都有1或2个糖识别域，对β半乳糖苷有特殊的亲和力，在许多正常组织、细胞中表达，参与多种生理、病理、免疫过程，如细胞的黏附、增殖、凋亡，炎症反应，固有免疫，适应性免疫等。Galectin与恶性肿瘤密切相关，参与了肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、免疫逃逸、耐药等过程。Galectin已成为肿瘤防治中的研究热点，并可能成为治疗的新靶点。半乳糖凝集素(Galectin)是一种糖蛋白，也称为肿瘤相关蛋白。糖蛋白是蛋白质通过糖基化与寡糖链共价相连构成的分子。糖基化是一种常见的蛋白质翻译后修饰形式，分为4类：N-糖基化，O-糖基化，糖基磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol,GP1)锚定的细胞和C-糖基化。糖基化水平的改变和癌症等众多疾病紧密相关，因此，特异性表达的糖链有望成为癌症等疾病诊断新的生物标志物，但是，有关这方面的研究目前国内外的报道还比较少。Galectin能够与糖基化的细胞外基质蛋白和膜蛋白相互作用，调节细胞黏附；Galectin还能与细胞表面糖基化的CD98结合上调整合素表达促进细胞与基质的结合；Galectin也能与肿瘤细胞表面的T抗原相互作用，介导了肿瘤细胞和内皮细胞的黏附，参与了糖基介导的肿瘤转移细胞的同型和异型的黏附。正是这种特异性的糖基化作用，提示可以用于富集肿瘤外泌体。粒子状的外泌体与细胞相比粒径虽然很小，但其表面却存在大量的糖蛋白、糖脂和糖链，在最外层与细胞一样被糖链覆盖，在外泌体标记开发中糖链可作为合适的标靶，可应用于临床上的肿瘤标记物识别多种不同糖链结构，如果可以捕捉到疾病特异性外泌体上糖链的变化，可以将外泌体应用于生物标记的开发。CN109324186A专利技术专利公开了Exo-CD82+(外泌体CD82蛋白表达量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有微流控芯片，所述微流控芯片包括基底层和位于基层上的顶层，上下两层相连通；基底层和顶层均设有微流通道和孔，微流通道与孔相连通，底层和顶层通过混合流道相通；基底层和顶层分别设有加样孔、反应孔、检测孔、质控孔、废液排出孔；所述基底层的反应孔包被半乳糖凝聚物-1的单克隆抗体或抗GPC1的IgG抗体；所述基底层的加样孔(11)和反应孔(12、13)喷涂聚乙二醇PEG6000聚合物，每孔喷涂聚乙二醇PEG6000聚合物10μl；所述基底层的反应孔固化有捕获纳米磁珠，所述磁珠与量子点标记外泌体抗GPC1特异性抗体的偶联。/n

【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有微流控芯片，所述微流控芯片包括基底层和位于基层上的顶层，上下两层相连通；基底层和顶层均设有微流通道和孔，微流通道与孔相连通，底层和顶层通过混合流道相通；基底层和顶层分别设有加样孔、反应孔、检测孔、质控孔、废液排出孔；所述基底层的反应孔包被半乳糖凝聚物-1的单克隆抗体或抗GPC1的IgG抗体；所述基底层的加样孔(11)和反应孔(12、13)喷涂聚乙二醇PEG6000聚合物，每孔喷涂聚乙二醇PEG6000聚合物10μl；所述基底层的反应孔固化有捕获纳米磁珠，所述磁珠与量子点标记外泌体抗GPC1特异性抗体的偶联。


2.如权利要求1所述的微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的试剂盒，其特征在于，所述基底层有2个反应孔，第一反应孔包被半乳糖凝聚物-1的单克隆抗体，第二反应孔包被抗GPC1的IgG抗体。


3.如权利要求1所述的微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的试剂盒，其特征在于，所述孔的直径均为1.5～5.5毫米，深度均为80～1000微米；所述微通道长度为6～18毫米，宽度为80～800微米，深度为100～2200微米。


4.如权利要求1所述的微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片的驱动力为注射泵。


5.如权利要求1所述的微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片的材料包括高分子聚合物聚二甲基硅氧烷醇(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、玻璃、聚碳酸酯(PC)或环烯烃共聚物树脂(COC)。


6.如权利要求1所述的微流控芯片检测外泌体GPC1蛋白的试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片的材料为二甲基硅氧烷醇(PDMS)。

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【专利技术属性】
技术研发人员：何凤屏，
申请(专利权)人：何凤屏，
类型：发明
国别省市：广东;44