一种含丙酮酸激酶的人卵母细胞体外成熟培养液及培养方法技术

本发明专利技术提供了M型丙酮酸激酶在人卵母细胞体外成熟培养液中的应用，以及一种人卵母细胞体外成熟培养液，所述培养液包括卵母细胞基础培养液、M型丙酮酸激酶、胰岛素样生长因子、性激素、表皮生长因子、抗生素和维生素E。本发明专利技术在基础培养基中添加了M型丙酮酸激酶(PKM1和PKM2)，通过PKM1与PKM2之间的特定比值使IGF

【技术实现步骤摘要】
一种含丙酮酸激酶的人卵母细胞体外成熟培养液及培养方法


[0001]本专利技术属于生殖医学
，具体涉及一种含丙酮酸激酶的人卵母细胞体外成熟培养液及培养方法

技术介绍

[0002]未成熟卵母细胞体外成熟培养(in vitro maturation，IVM)技术是辅助生殖技术的一种，它是通过模拟体内卵母细胞的成熟环境，在体外对未成熟卵母细胞进行培养，使其发育为成熟的第二次减数分裂中期(MII)的卵母细胞，具有受精、发育为正常胚胎的能力。随着IVM技术在辅助生殖
里的应用和发展，使不孕的育龄妇女尤其是顽固的卵泡成熟障碍患者，获得妊娠。
[0003]目前商品化的人未成熟卵母细胞体外成熟培养液，虽然含有HCG和促性腺激素、雌二醇，FSH、胎牛血清、人血白蛋白等，模拟人卵母细胞体内成熟的环境，但是存在妊娠成功率低，质量不稳定，价格昂贵。国外有研究报道，在卵母细胞培养液中加上生长因子、胰岛素生长因子
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1(IGF
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1)和表皮生长因子(EGF)可以促进卵母细胞成熟(Jimenez CR,Reprod Domest Anim,2018,53(5):1103
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1113)；但有学者发现加入以上生长因子仍没有解决卵母细胞核和细胞质同步成熟等问题(K,Reprod Biol.2014,14(2):122
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7)；近期的研究提出，低浓度的IGF
‑
1不能促进卵母细胞核的成熟，且高浓度IGF
‑
1抑制卵母细胞成熟(Cardilli DJ,et al.Vet Med Sci.2021,7(1):46
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56)。目前造成IVM技术不成熟的主要原因是培养未成熟卵母细胞的成熟液不够成熟，同时，未成熟卵细胞的成熟时间也不确定，因为IVM体外培养时间过长或过短均可能使卵母细胞错过最佳授精时间，从而影响授精及妊娠。因而，配制高质量未成熟卵母细胞的体外培养成熟液和合理的培养时间是本领域要解决的关键问题。
[0004]丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)能使磷酸烯醇式丙酮酸和ADP变为丙酮酸和ATP，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，有M型和L型两种同工酶，M型又有M1及M2亚型。M1分布于心肌、骨骼肌和脑组织；M2分布于脑及肝脏等组织。L型同工酶主要存在于肝、肾及红细胞内。目前尚未发现将PK应用于人卵母细胞体外成熟培养液中。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种适用于人卵母细胞体外成熟的培养液。该培养液中含有M型丙酮酸激酶，能够提高卵母细胞体外发育能力，使得卵母细胞核和细胞质同步成熟能够同时成熟。
[0006]本专利技术采用以下技术方案实现本专利技术的目的：
[0007]第一个方面，本专利技术提供了M型丙酮酸激酶在人卵母细胞体外成熟培养液中的应用。
[0008]优选地，所述M型丙酮酸激酶包括丙酮酸激酶M1型和丙酮酸激酶M2型。
[0009]PKM1和PKM2分别是丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)M型同工酶的两个亚型M1型
和M2型。丙酮酸激酶亚型PKM2包含外显子10，在增殖细胞(包括癌细胞)中大量存在，并促进有氧糖酵解；丙酮酸激酶亚型M1
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PK包含外显子9，在分化细胞中高表达，并促进氧化磷酸化。PKM1和PKM2分别是氧化磷酸化和有氧糖酵解的关键酶，是ATP生成所必需的。葡萄糖代谢水平是由它们的绝对水平和PKM1/PKM2的比值决定的。PKM1和PKM2的水平及其比值在不同的细胞和组织中存在差异，PKM1与PKM2的表达水平还随着发育和分化而变化。
[0010]第二个方面，本专利技术提供一种人卵母细胞体外成熟培养液，所述培养液包括卵母细胞基础培养液、M型丙酮酸激酶、胰岛素样生长因子、性激素、表皮生长因子、抗生素和维生素E。
[0011]PKM1和PKM2均存在于卵母细胞中，专利技术人发现PKM1可能通过调控一些生长因子从而影响卵母细胞的质量和成熟，例如胰岛素和胰岛素生长因子。与卵母细胞的ATP和能量代谢密切相关，通过有氧糖酵解途径以PKM1:PKM2的水平调控胰岛素和胰岛素生长因子的水平。
[0012]优选地，所述M型丙酮酸激酶包括丙酮酸激酶M1型和丙酮酸激酶M2型，以卵母细胞基础培养液为基准计，丙酮酸激酶M1型和丙酮酸激酶M2型质量浓度之比为PKM1:PKM＝5～60:1。经试验证实，当PKM1:PKM＝5～60:1时，使IGF
‑
1维持低水平表达，从而达到促进卵母细胞的细胞核与细胞质的同步成熟。
[0013]优选地，以卵母细胞基础培养液为基准计，所述丙酮酸激酶M1型的质量浓度为50～300mg/ml，丙酮酸激酶M2型的质量浓度为10～50mg/ml。
[0014]优选地，所述胰岛素样生长因子包括胰岛素样生长因子
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1和胰岛素样生长因子
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2，以卵母细胞基础培养液为基准计，胰岛素样生长因子
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1的质量浓度为10～50ng/ml，胰岛素样生长因子
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2的质量浓度为20～80ng/ml。PKM1促进IGF
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1在未卵母细胞体外成熟培养中，当IGF
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1质量浓度为10～50ng/ml，胰岛素样生长因子
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2的质量浓度为20～80ng/ml，为细胞提供低能量代谢、低氧和低糖水平环境，从而促进卵母细胞核成熟。
[0015]优选地，所述性激素包括促卵泡生成素、黄体生成素促黄体生成素、人绒毛膜促性腺激素和雌激素，以卵母细胞基础培养液为基准计，促卵泡生成素的浓度为50～300mIU/ml，黄体生成素促黄体生成素的浓度为50～300mIU/ml、人绒毛膜促性腺激素的浓度为50～500mIU/ml、雌激素的浓度为50～500mIU/ml。本专利技术在所述培养基中添加性激素的目的在于，一方面可以促使卵母细胞核和细胞质同步成熟，另一方面可以提高卵母细胞体外受精后的胚胎发育潜能。
[0016]所述抗生素包括青霉素和链霉素，以卵母细胞基础培养液为基准计，青霉素的浓度为100～200IU/ml，链霉素的浓度为100～200μg/ml。
[0017]优选地，以卵母细胞基础培养液为基准计，所述表皮生长因子的质量浓度为10～50ng/ml；所述维生素E的质量浓度为10～50μmol/L。本专利技术在所述培养基中添加维生素E的目的在于，维生素E能够促性腺激素增加，促进各阶段的卵泡发育，调整免疫细胞功能，减少外界环境带来的应激损伤，促进卵母细胞质的成熟。
[0018]优选地，所述培养基还包括胎牛血清和人血白蛋白，以卵母细胞基础培养液为基准计，胎牛血清的浓度为10～50ng/ml、人血白蛋白浓度为20～80ml。
[0019]第三个方面，本专利技术提供了一种人卵母细胞体外成熟培养方法，包括以下步骤：将处于第1次减数分裂中期的人未成熟卵母细胞移入含有本专利技术培养液的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.M型丙酮酸激酶在人卵母细胞体外成熟培养液中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述M型丙酮酸激酶包括丙酮酸激酶M1型和丙酮酸激酶M2型。3.一种人卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述培养液包括卵母细胞基础培养液、M型丙酮酸激酶、胰岛素样生长因子、性激素、表皮生长因子、抗生素和维生素E。4.如权利要求3所述的培养液，其特征在于，所述M型丙酮酸激酶包括丙酮酸激酶M1型和丙酮酸激酶M2型，以卵母细胞基础培养液为基准计，丙酮酸激酶M1型和丙酮酸激酶M2型质量浓度之比为PKM1:PKM＝5～60:1。5.如权利要求4所述的培养液，其特征在于，以卵母细胞基础培养液为基准计，所述丙酮酸激酶M1型的质量浓度为50～300mg/ml，丙酮酸激酶M2型的质量浓度为10～50mg/ml。6.如权利要求3所述的培养液，其特征在于，所述胰岛素样生长因子包括胰岛素样生长因子
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1和胰岛素样生长因子
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2，以卵母细胞基础培养液为基准计，胰岛素样生长因子
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1的质量浓度为10～50ng/ml，胰岛素样生长因子
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2的质量浓度为20～80ng/ml。7.如权利要求3所述的培养液，...

【专利技术属性】
技术研发人员：何凤屏，刘彦慧，
申请(专利权)人：何凤屏，
类型：发明
国别省市：