一种人呼吸道病原体快速诊断的定量检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种人呼吸道病原体快速诊断的定量检测方法和试剂盒，该试剂盒由：至少一种人呼吸道病原体抗体捕获微球、PE标记的检测抗体、病原体蛋白标准品、流式细胞仪校正微球，微球缓冲液、细胞裂解液、样品稀释液、清洗液组成，本发明专利技术具有操作简便、快速、自动化，检测结果灵敏度高、检测范围广、重复性好，可实现对人呼吸道上皮细胞和体液中多种病原体的定量检测，且检测对象可灵活组合，能更真实反映病原体的感染情况。

A quantitative detection method and kit for rapid diagnosis of human respiratory pathogens

【技术实现步骤摘要】
一种人呼吸道病原体快速诊断的定量检测方法和试剂盒
本专利技术属于病原体诊断
，具体涉及了一种人呼吸道病原体快速诊断的定量检测方法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。
技术介绍
呼吸道感染是我国最常见的传染性疾病，大多数由呼吸道病毒引起，可分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，。流感病毒（IFV）、副流感病毒（PIV）、腺病毒（HAdV）、偏肺病毒（MPV）、冠状病毒（CoV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、鼻病毒（RhV）、肠道病毒(EV)、博卡病毒（HBoV）、肺炎支原体、肺炎衣原体是常见的呼吸道病原体，因此快速检测病原体种类，对疾病的及时诊断、抗生素和抗病毒药物的合理使用和预防感染有着重要作用。流式细胞术是利用流式细胞仪快速定量分析细胞群的物理化学特征的技术，主要应用于检测外周血淋巴细胞及其亚群数量，监测HIV感染者疾病的进展；利用流式分选干细胞过继回输用于疾病的治疗，及其辅助白血病的诊断和分型。CBA,微量样品多重蛋白定量技术，是基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法。即利用微小、分散的颗粒微球捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的微球－待测物复合体所散发的荧光，从而测定待测物的数量。目前主要用于检测血液样本中的细胞因子、炎症因子的水平分析。目前呼吸道病毒感染诊断的金标准仍是病毒的的分离培养，但是细胞培养方法周期长，运输和储存易感染，实际应用受到限制。玻片直接免疫荧光法，则需要通过肉眼观察绿色荧光细胞的数量来判定结果，因此结果的判定具有主观性，且一次只能用单一荧光素标记的抗体，故一次只能鉴定一种病原体，检测效率低。目前市面上的利用流式细胞术检测呼吸道病原体的技术和产品主要是通过固体液固定住细胞，利用通透剂对细胞内的病毒进行荧光染色，染色效率受通透率影响大，还不能定量分析。
技术实现思路
本专利技术提供了一种人呼吸道原体快速诊断的定量检测方法和试剂盒，以及该试剂盒的制备及使用方法。本专利技术检测快速准确，灵敏度高、重复性好，并且操作简便、自动化，可实现单样本的多重定量检测，且检测对象可灵活组合，能更真实的反映病原体的感染情况。本专利技术是通过以下技术方案来实现的：一种基于流式细胞检测和微量多重蛋白定量检测的人呼吸道病原体快速诊断和检测的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1)呼吸道病原体抗体和捕捉微球的共价耦合：将标记有APC荧光素的聚苯乙烯微球分别与人呼吸道病原体抗体偶联（其中人呼吸道病原体包括呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、支原体或衣原体），制得人呼吸道病原体抗体捕获微球；不同抗体结合的微球APC荧光强度不同，通过APC荧光强度可识别不同的病原体抗体。2）检测抗体的荧光标记：用PE荧光素标记检测抗体，所述检测抗体与捕获抗体为配对抗体。3）标准曲线的制备：将等比稀释的0-5000不同浓度的标准品蛋白与捕捉微球和检测抗体等体积混合后，室温避光孵育反应，加入清洗液后，将该复合物置于流式细胞仪，检测PE通道荧光强度，通过FSC和SSC确定微球位置后，再通过荧光强度的不同判定病原体的种类，分别绘制不同病原体蛋白的标准曲线，其中，曲线坐标为病原体浓度和检测平均荧光强度（MFI）。4）待测样品处理和检测：使用咽拭子收集呼吸道上皮细胞，将咽拭子放入含培养基的采样管中，4℃保存；检测时涡旋振荡采样管，取出拭子，离心后，小心吸去上清，加入4℃预冷的细胞裂解液，至细胞裂解完全，离心取上清，加入抗体捕获微球和PE检测抗体，混合孵育后，上流式细胞仪检测。5）检测结果分析：根据微球自带的APC和APC-cy7两种荧光，分别在APC和APC-cy7通道检测，通过二位矩阵识别捕获微球，确定微球的位置，划分微球门，再根据PE标记的检测抗体在PE通道来对目的病原体定量。6）检测法临界值的判定：分别检测30份阴性样本咽拭子的值，统计并计算出该样本的平均值和标准差。根据统计学原则，当样本值大于阴性样本值的平均值与3倍标准差之和时，便可在99%的水平上判定为阳性，计算出阴阳性临界值。一种基于流式细胞检测和微量多重蛋白定量检测的人呼吸道病原体快速诊断及检测试剂盒，包括人呼吸道病原体抗体的一种或多种组合捕捉微球，PE标记的检测抗体试剂（一种或多种组合），标准品蛋白（一种或多种组合），流式细胞仪校准微球，样品缓冲液，微球缓冲液，细胞裂解液，清洗液。其中所述的呼吸道病原体包括呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、支原体或衣原体中的至少一种。一种用于制备基于流式细胞检测和微量多重蛋白定量检测的人呼吸道病原体快速诊断及检测的试剂盒的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：1）人呼吸道病原体抗体的捕捉微球制备：1.1）溶液配制bufferA的配制：称取0.96g磷酸氢二钠，加去离子水600mL溶解，调节pH至6.0，再加水定容至800mL，0.45μm水系过滤膜过滤；bufferB的配制:称取甘氨酸7.5g，加水800mL溶解，调节pH至7.5，再加水定容至1000mL，0.45um水系过滤膜过滤；50mg/ml1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基-碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液配制:称取1gEDC，加入50mL水溶解，0.45μm水系过滤膜过滤；1.2）微球共价结合抗体1.2.1）使用bufferA悬浮标有APC荧光素的微球，使微球浓度为1%w/v1.2.2）每1ml微球悬液中加入20mg的EDC，室温孵育20min，再加入20mg/mL的EDC，室温孵育20min1.2.3）1000rpm/min离心5min，弃上清，加入等体积的bufferB缓冲液，反复清洗微球两次1.2.4）使用500ulbufferB重悬微球1.2.5）使用bufferB缓冲液溶解病原体抗体，至终浓度为1mg/mL1.2.6）将抗体加入微球缓冲液中，涡旋混匀，室温，避光孵育2-4h,1.2.7）使用微球缓冲液将标记后的微球抗体偶联物清洗两次后，重悬保存。2）检测抗体的荧光素标记：2.1）将5-10mg活化处理的荧光素PE,使用脱盐柱置换到PH6.0反应缓冲液中，调节浓度至5-10mg/mL,体积为1mL。2.2）取活化抗体0.8mL，加入活化PE溶液0.571mL，再加入0.137mL苯胺溶液。混匀后，避光，置于旋转混合仪上2h。2.3）用AKTA蛋白纯化仪进行纯化，用0.5倍柱体积的超声脱气纯化水进行平衡，流速为0.5-1mL/min，再用约1.5倍柱体积的0.05M洗脱缓冲液平衡，流速为0.5-1mL/min，上样，后用0.05洗脱缓冲液洗脱，收集所需峰值附近液体。2.4）使用紫外可见分光光度计检测抗体浓度和抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于流式细胞检测和微量多重蛋白定量检测的人呼吸道病原体快速诊断和定量检测的方法，其特征在于，包括：呼吸道病原体抗体和捕捉微球的共价耦合、检测抗体荧光标记、标准曲线的绘制、待测样品处理及检测、结果分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于流式细胞检测和微量多重蛋白定量检测的人呼吸道病原体快速诊断和定量检测的方法，其特征在于，包括：呼吸道病原体抗体和捕捉微球的共价耦合、检测抗体荧光标记、标准曲线的绘制、待测样品处理及检测、结果分析。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的样本处理为使用细胞裂解液4度裂解10-20min。


3.一种基于流式细胞检测和微量多重蛋白定量检测的人呼吸道病原体快速诊断及定量检测的试剂盒，包括人呼吸道病原体抗体的一种或多种组合捕捉微球，PE标记的检测抗体试剂（一种或多种组合），标准品蛋白（一种或多种组合），流式细胞仪校准微球，微球缓冲液，样品缓冲液，裂解液，清洗液；其中所述的呼吸道病原体包括呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IA)、乙型流感病毒(IB)、腺病毒(Adv)、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、支原体或衣原体中的至少一种或多种组合。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪建，
申请(专利权)人：天津美瑞特医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12