一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的方法，包括如下步骤：（1）血小板抗原特异性荧光微球的制备；（2）检测抗体的制备；（3）血小板对照品的制备（4）检测反应体系；（5）待测样本检测。本发明专利技术的另一目的在于提供一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的检测试剂盒，包括由不同的抗血小板特异性糖蛋白抗体包被在不同的荧光微球表面得到的血小板抗原特异性荧光微球、微球缓冲液、血小板对照品、血小板裂解液、清洗液、校准微球以及检测抗体。所述的血小板特异性抗体检测方法，解决了现有技术中的血小板抗体检测主要针对被检测者自身血小板抗体，并非血浆或血清中游离的血小板抗体的问题，同时可以更近一步地确定被检测者存在抗体的血小板特异性抗原（HPA）的类型，并且本发明专利技术所述方法样本用量少、结果更加准确、步骤简单、易操作、效率更高。

A method and kit for the detection of platelet antibody specificity by flow cytometry

【技术实现步骤摘要】
一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的方法及检测试剂盒
本专利技术属于免疫诊断检测领域，具体涉及一种应用流式细胞术对血小板抗体特异性进行检测的方法及检测试剂盒。
技术介绍
血小板抗体是患者在输血、妊娠或移植等过程中接触外来血小板抗原所产生的致病性抗体，可致敏血小板并使其遭到破坏，引起血小板减少，导致血小板输注无效症（plalelettransfusionrefractoriness,PTR），胎母同种异体免疫血小板减少症（foetal-maternalalloimmunethromLocytepenia,FMAIT），输血后紫癜（posttransfusionpurpura,PTP），以及移植相关同种异体免疫血小板减少症（transplantation-associatedalloimmunethrombocytopenia,TAAT）等多种病症，患者易出现淤点、瘀斑及出血等症状，严重者甚至会发生死亡。免疫性疾病患者在机体免疫系统紊乱的情况下亦可产生针对自身血小板的抗体，导致自身免疫性血小板减少症（idiopathicthrombocytopenia,ITP）。血小板抗体包括HLAI类抗体及抗血小板糖蛋白或HPA抗体。临床血小板相关免疫性疾病患者体内通常能检出抗HLAⅠ类抗体。但血小板更多的是由抗GP或HPA抗体等多种抗体共同作用，包括抗GPIV、抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPⅠa/Ⅱa、抗GPⅠb/Ⅸ、抗CD109抗体等。流式细胞术是近些年发展起来的新技术，能够对一个样本进行多参数高通量检测，检测速度快、精度高、准确性好。CBA（cytometricbeadarray）即微量样本多指标流式蛋白定量技术，是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。CBA是流式细胞术的进阶版，利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒—“捕获微球-待测物-检测抗体夹心复合物”所散发的荧光，从而测定待测物的数量，这种方法对样本需求量更少，检测更快速、更准确。目前，已有的检测血小板抗体方法和试剂盒主要针对患者体内的自身血小板抗体，即与患者血小板表面抗原结合的抗体。该检测方法主要应用在自身免疫性血小板减少症患者体内的自身血小板抗体检测，而临床血小板较少症患者大多数为同种异体免疫性疾病患者，此类患者也需要检测的是血液中或血浆中游离的血小板抗体（即非自身血小板抗体）。更进一步的，目前针对被检测者体内存在具体某种血小板特异性抗原（HPA）的抗体在临床上的检测方法更是数量稀少。根据上述情况，需要一种方法检测被检测者的血液或血浆中游离的血小板抗体，同时具体到某种HPA的抗体，且该方法需要具有特异性高、灵敏度好、操作简便、检测快速等特点。因此，研发一种快速且特异性高的血小板抗体特异性检测方法及试剂盒具有很大的必要性。。
技术实现思路
通过本专利技术所述的检测方法与试剂盒，能够快速地检测出待测样本中血小板特异性抗体。为实现上述目的，通过以下方法及步骤实验：一种血小板抗体特异性检测方法，包括如下步骤：血小板抗原特异性荧光微球的制备将标记有APC荧光素的聚苯乙烯微球加入稀释好的鼠抗人抗体中，室温涡旋振荡，使抗血小板特异性糖蛋白抗体包被微球，不同的抗血小板特异性糖蛋白抗体与不同荧光强度的微球相结合，得到血小板抗原特异性荧光微球。检测抗体的制备用荧光素PE标记羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体，即为检测抗体。血小板对照品的制备选择6名健康O型血志愿者，使用PCR-SSP对志愿者进行血小板HPA基因分型，分离志愿者血液中的血小板并保存。检测反应体系：血小板抗原特异性荧光微球10μL+（血小板对照品+待测样本+血小板裂解液）30μL+检测抗体100μL所述反应体系中，检测抗体上标记PE荧光素，将微球和检测抗体以及待测样本混合后，若存在血小板特异性抗体，就形成了“微球-抗血小板特异性糖蛋白抗体-血小板特异性糖蛋白游离抗体-PE标记的羊抗人多克隆抗体”这样的夹心复合物，通过流式测定PE荧光强度，以及已知分型血小板对照，即可判断血小板抗体特异性并确定被检测者体内血小板特异性抗体的HPA类型。待测样本检测通过流式细胞仪检测待测样本复合物PE通道的荧光强度MFI，以及已知分型血小板对照，即可检测血小板抗体特异性。本专利技术的另一目的在于提供一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的检测试剂盒，技术方案如下：一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的检测试剂盒，包括由不同的抗血小板特异性糖蛋白抗体包被在不同的荧光微球表面得到的血小板抗原特异性荧光微球、微球缓冲液、血小板标准品、血小板裂解液、校准微球以及检测抗体。其中校准微球用于调整FSC和SSC，得到微球群。所述血小板抗原特异性荧光微球：包括以抗血小板特异性糖蛋白GPIV抗体包被在荧光微球a的表面，得到的血小板抗原特异性荧光微球1；以抗血小板特异性糖蛋白GPⅡb/Ⅲa抗体包被在荧光微球b的表面，得到的血小板抗原特异性荧光微球2；以抗血小板特异性糖蛋白GPⅠa/Ⅱa抗体包被在荧光微球c的表面，得到的血小板抗原特异性荧光微球3；以抗血小板特异性糖蛋白GPⅠb/Ⅸ抗体包被在在荧光微球d的表面，得到的血小板抗原特异性荧光微球4；和以抗血小板特异性糖蛋白CD109抗体包被在荧光微球e的表面，得到的血小板抗原特异性荧光微球5。所述血小板标准品，是由6名O型血健康志愿者提供的血液中提取的已经通过PCR-SSP进行血小板HPA基因分型的血小板。本专利技术技术方案，具有如下优点：（1）本专利技术所述的血小板抗体特异性检测方法，先将血小板标准品与待测样品进行孵育，使待测样品中的血小板抗体可以与血小板对照品充分结合，然后裂解血小板，使不同的抗血小板特异性糖蛋白抗体包被在不同的荧光微球表面获得的血小板抗原特异性荧光微球与裂解液中的抗体结合，然后加入PE标记的羊抗人多克隆抗体。若被检测者体内存在血小板特异性抗体，则会形成“微球-抗血小板特异性糖蛋白抗体-血小板特异性糖蛋白游离抗体-PE标记的羊抗人多克隆抗体”的复合结构，表现出荧光增强，再结合已经进行HPA基因分型的血小板对照品，进而可以检测出被检测者血浆或血清中游离的血小板某HPA的抗体，检测得到的血小板抗体结果更精确，解决了现有技术中的血小板抗体检测仅针对自身血小板抗体的问题，填补了无法测定某种具体血小板特异性抗原的抗体的空白，同时所述方法样本用量少、结果更为精确、步骤简单、易操作、效率更高。（2）本专利技术所述的血小板抗体特异性检测方法，所述抗血小板特异性糖蛋白抗体为抗GPIV、抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPⅠa/Ⅱa、抗GPⅠb/Ⅸ和抗CD109抗体；通过选择上述的抗血小板特异性糖蛋白抗体包被微球得到的血小板抗原特异性荧光微球可以实现一次性同时检测与自身血小板结合的和血浆或血清中游离的抗GPIV、抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPⅠa/Ⅱa、抗GPⅠb/Ⅸ、抗CD109抗体等五类血小板抗体的特异性，检测更全面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的方法，其特征在于，包括：血小板抗原特异性荧光微球的制备、检测抗体的制备、血小板对照品的制备、检测反应体系以及待测样品的检测。/n

【技术特征摘要】
1.一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的方法，其特征在于，包括：血小板抗原特异性荧光微球的制备、检测抗体的制备、血小板对照品的制备、检测反应体系以及待测样品的检测。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述特异性抗体包括抗GPIV抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗GPIa/IIa抗体、抗GPIb/IX抗体和抗CD109抗体。


3.一种用于血小板抗体特异性检测的试剂盒，其特征在于，包括由不同的抗血小板特异性糖蛋白抗体包被在不同的荧光微球表面得到的血小板抗原特异性荧光微球、微球缓冲液、血小板对照品、血小板裂解液、清洗液、校准微球以及检测抗体。


4.根据权利要求3所述的血小板抗原特异性荧光微球材料为APC荧光...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪建，
申请(专利权)人：天津美瑞特医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12