本发明专利技术公开了一种乙酰木聚糖酯酶基因、其编码产物及制备方法，所述乙酰木聚糖酯酶基因命名为Est1051，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明专利技术还公开了含有所述乙酰木聚糖酯酶基因的重组质粒pET28a‑Est1051，本发明专利技术还公开了乙酰木聚糖酯酶的制备方法，将所述乙酰木聚糖酯酶基因Est1051在大肠杆菌原核表达系统中过量表达，该乙酰木聚糖酯酶在大肠杆菌表达体系中高效可溶性表达。同时，采用所述方法得到的乙酰木聚糖酯酶，具有较高的催化活性和热稳定性,有很大的工业化生产和应用前景。
Acetyl xylanase gene, coding product and preparation method
【技术实现步骤摘要】
一种乙酰木聚糖酯酶基因、其编码产物及制备方法
本专利技术涉及一种基因重组
，尤其涉及如何获得乙酰木聚糖酯酶基因及其编码产物的技术。
技术介绍
半纤维素是自然界中除纤维素以外最丰富的可再生生物资源。木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的重要组成成分，约占植物细胞干重的15％-35％。这些木糖聚合物中广泛连接乙酰基、阿拉伯糖基、阿魏酸和4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸残基等基团，形成不同的侧链基团，因而木聚糖具有多种多样的结构。木聚糖侧链上的乙酰基团的存在对木聚糖酶降解木聚糖产生了阻碍作用，进而影响底物的水解效率，产生空间障碍，限制了主链降解酶和主链的接触，降低了可及性。乙酰木聚糖酯酶(acetylxylanesterase，AXE)可消除乙酰化木聚糖中木糖残基C-2和C-3位的O-乙酰取代基，从而提高木聚糖酶对主链的可及性，改善细胞壁中木聚糖酶的水解效率。乙酰木聚糖酯酶是目前了解最少的植物细胞壁降解酶系之一。该酶在1985年首次发现之后，越来越多的不同类型的乙酰木聚糖酯酶被发现和研究。工业上降解木聚糖经常采用酸法或碱法，但酸、碱水解过程往往伴有副反应，产生较多的有毒物质，对于后期微生物发酵有抑制作用，且产生的酸、碱废液会造成较大的环保压力，因此，酶法降解木聚糖以其温和环保的优势将会成为未来木聚糖降解的主要方式。乙酰木聚糖酯酶作为半纤维素酶系成员之一具有良好的应用前景。在工程菌构建方面,乙酰木聚糖酯酶的研究对于构建产量高、协同效果优异的半纤维素酶工程菌具有重要意义。在工业应用方面,乙酰木聚糖酯酶能够协同内切木聚糖酶和β-木糖苷酶将半纤维素彻底降解为木糖,进而转化为木糖醇等。另外,一些乙酰木聚糖酯酶能够作用于甲壳素的乙酰基,因此可以应用酶法制备壳聚糖,在药物、纺织、造纸、化妆品等方面具有广阔应用前景。目前，相对于其他木质纤维素降解酶系，对乙酰木聚糖酯酶的研究还远远不够，乙酰木聚糖酯酶与其他木质纤维素降解酶系的协同作用已经得到认可，其潜在应用价值还有待开发。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种乙酰木聚糖酯酶的基因及其制备方法。本专利技术的第二个目的在于提供一种乙酰木聚糖酯酶及其制备方法。本专利技术的第三个目的在于提供一种乙酰木聚糖酯酶的重组质粒pET28a-Est1051。本专利技术的第四个目的在于提供含有上述乙酰木聚糖酯酶的重组工程菌。本专利技术的第一个目的、第三个目的、第四个目的是通过如下技术方案来实现的：一种乙酰木聚糖酯酶的基因，命名为Est1051，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：基因的制备步骤如下：(1)从样品中提取总DNA，纯化总DNA，酶切总DNA；(2)回收步骤(1)得到的酶切后的DNA片段，将DNA片段和pUC118载体连接，得到质粒；(3)将步骤(2)所得质粒转化、文库筛选和阳性克隆子鉴定；(4)测序，将质粒命名为pUC118-Est1051，并设计PCR引物；(5)以质粒pUC118-Est1051为模板，PCR扩增进行基因克隆；(6)将PCR产物纯化，得到乙酰木聚糖酯酶基因。进一步地，所述PCR引物是：Est1051-F：CCGGAATTCCCCGTTGCGGTGTCATTATACTGAC(下划线部分为EcoRⅠ的酶切位点)；Est1051-R：CCGCTCGAGGCTCCCGAAGAACCTATGAAACCAATTG(下划线部分为XhoⅠ的酶切位点)。进一步地，所述步骤(5)的操作是：以质粒pUC118-Est1051为模板、Est1051-F和Est1051-R为引物，采用PrimeSTARTMMaxPremix进行Est1051基因片段的PCR扩增，体系如下：PCR的反应条件是：第一阶段：95℃变性2min；第二阶段：95℃变性10sec，60℃退火5sec，72℃延伸5sec，共30个循环；第三阶段：72℃延伸10min，最后于4℃保存。本专利技术的第二个目的是通过如下技术方案实现的：一种乙酰木聚糖酯酶，它的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示：酶的制备方法：把权利要求1的乙酰木聚糖酯酶基因与pET-28a(+)表达载体连接，获得连接产物重组质粒pET-28a(+)-Est1051，把重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中形成重组工程菌，培养重组工程菌，破碎，得到粗酶液，纯化，得到乙酰木聚糖酯酶。更详细地，把权利要求1的乙酰木聚糖酯酶基因与pET-28a(+)表达载体连接，获得连接产物重组质粒pET-28a(+)-Est1051，把重组质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中形成重组工程菌，重组工程菌接种在LB液体培养基中活化，然后把活化后菌体浓度为OD600nm＝1.2的重组工程菌母液接种于另一LB液体培养基中，加入终浓度为0.8mM的IPTG，37℃培养10h，离心去上清，破碎，得到粗酶液，纯化，得到乙酰木聚糖酯酶。本专利技术的有益效果：①本专利技术从实验室前期筛选中得到一个新的乙酰木聚糖酯酶基因Est1051，Est1051为一个1051bp大小的完整乙酰木聚糖酯酶基因，利用BLAST在线比对其核苷酸序列进行同源性搜索分析表明，所述乙酰木聚糖酯酶基因Est1051与已知基因亲缘性关系远。②通过基因工程技术对该乙酰木聚糖酯酶基因做功能研究，发现该序列在大肠杆菌BL21中高效可溶表达，经蛋白纯化及SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，由于pET28a载体编码硫氧还蛋白和六联组氨酸标签等与目的蛋白融合表达，因此电泳中重组乙酰木聚糖酯酶的相对分子量约为50kDa.③本专利技术将SEQIDNO.1所示的DNA序列克隆到原核表达载体上，转化入大肠杆菌BL21感受态细胞，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下：(1)在大肠杆菌表达体系中，该重组蛋白具有高效可溶性表达。(2)用对硝基苯酚乙酸酯为底物，所述乙酰木聚糖酯酶的最适反应温度为40℃，在温度为4～45℃之间，剩余酶活力均在50％以上，稳定性良好，表明该重组乙酰木聚糖酯酶具有耐高温及热稳定性方面优势；该重组蛋白的最适反应pH为7.0，在pH5-7.5之间，剩余酶活力均在50％以上，稳定性良好；当金属离子浓度为1mM时，Zn2+和Mn2+对酶活性有促进作用，当金属离子浓度为10mM时，Mg2+和Fe2+对酶活性有促进作用，说明该重组酶具有较高程度的耐金属离子特性。此外，1％的DMSO、甲醇能够促进酶活性，但比较特殊的是随着异丙醇和TritonX-100浓度的提高，重组乙酰木聚糖酯酶的酶活力反而提高，表明该重组乙酰木聚糖酯酶具有较高程度耐受有机溶剂的特性。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术的不当限定，在附图中：图1是本专利技术实施例1乙酰木聚糖酯酶基因Est1051P本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种乙酰木聚糖酯酶基因，其特征在于：/n命名为Est1051，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种乙酰木聚糖酯酶基因，其特征在于：
命名为Est1051，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶基因编码的乙酰木聚糖酯酶，其特征在于：
其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
3.包含权利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶基因的重组质粒。
4.包含权利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶基因的重组质粒pET-28a(+)-Est1051。
5.包含权利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶基因的重组工程菌。
6.一种如权利要求1所述的乙酰木聚糖酯酶基因的制备方法，其特征在于：
步骤如下：
(1)从样品中提取总DNA，纯化总DNA，酶切总DNA；
(2)回收步骤(1)得到的酶切后的DNA片段，将DNA片段和pUC118载体连接，得到质粒；
(3)将步骤(2)所得质粒转化、文库筛选和阳性克隆子鉴定；
(4)测序，将质粒命名为pUC118-Est1051，并设计PCR引物；
(5)以质粒pUC118-Est1051为模板，PCR扩增进行基因克隆；
(6)将PCR产物纯化，得到乙酰木聚糖酯酶基因。
7.根据权利要求6所述的乙酰木聚糖酯酶基因的制备方法，其特征在于：
所述PCR引物是：
Est1051-F：CCGGAATTCCCCGTTGCGGTGTCATTATACTGAC
(下划线部分为EcoRⅠ的酶切位点)；
Est1051-R：CCGCTCGAGGCTCCCGAAGAACCTATGAAACCAATTG
【专利技术属性】
技术研发人员：李荷，张梦乐，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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