基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用技术方案

本发明专利技术提供了一种基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用，所述的单碱基基因编辑系统包含能够表达融合蛋白的mRNA和目的编辑位点对应的gRNA，所述融合蛋白包含D10A缺陷型Cas9蛋白和脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA，所述的脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA对应的基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术为研究甲壳动物SNP位点的功能提供了新的技术手段，有利于甲壳动物基因功能的研究，并对经济甲壳动物分子精准育种的实施和发展提供了基础。

Construction and application of a single base gene editing system based on cytidine deaminase

【技术实现步骤摘要】
基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用
本专利技术涉及基因编辑
，具体涉及一种基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用。
技术介绍
以虾蟹为代表的十足目甲壳动物是水产养殖的重要品种，在渔业发展中占有重要地位。随着社会经济的发展，人们对水产品多样化的需求逐渐提高，也对新品种培育和品种改良提出了更高的要求。如何获得更多更优质的海水养殖品种一直是国内外科学家致力于研究的重要内容。传统育种方法周期长、效率低，逐渐不能满足人们对良种选育的要求。基于此，快捷、高效且能够实现关键生产性状基因定向的分子育种技术具有十分广阔的发展空间。随着高通量测序技术的发展，多种甲壳动物基因组测序已经完成或即将完成，大量功能基因被挖掘出来。深入分析基因的功能，将有助于从分子水平上揭示甲壳动物的生命活动规律。对功能基因与生产性状之间关系的阐释，可以为育种关键基因的选择与评价提供可靠依据。研究发现，甲壳动物基因组中存在大量单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位点，深入研究这些SNP位点(尤其是一些引起功能基因异义突变的SNP位点)的作用，对阐释甲壳动物的繁殖发育、生长和抗逆等生理生化过程具有重要意义。目前，ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因编辑工具应用广泛，为功能基因的研究提供了有力工具。但由于它们都是基于双链断裂和同源重组、非同源末端连接实现基因编辑的，会产生随机indels，无法实现特点基因位点单个碱基的替换，对研究SNP位点的功能存在先天不足。此外，不同基因编辑工具对特定编辑对象的编辑效率也有较大差异，目前还没有关于针对甲壳类动物基因编辑的专门基因编辑系统。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种基于脊尾白虾胞苷脱氨酶的单碱基基因编辑系统及其构建和应用，以为甲壳动物的基因定向分子育种提供专门的基因编辑系统。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA基因，所述基因的序列如SEQIDNO.1所示。所述基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一种基于脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA的单碱基基因编辑系统，所述单碱基基因编辑系统包含能够表达融合蛋白的mRNA和目的编辑位点对应的gRNA，所述融合蛋白包含D10A缺陷型Cas9蛋白和脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA，所述的脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA对应的基因序列如SEQIDNO.1所示。上述的单碱基基因编辑系统的构建方法，包括以下步骤：a、利用RACE技术，从脊尾白虾cDNA文库中克隆脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA基因；b、以pCMV-Cas9质粒为模板，利用反向PCR引物，将Cas9蛋白RuvC结构域的第10位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸，使RuvC结构域失活，从而得到含有D10A缺陷型Cas9蛋白基因的质粒pCMV-nCas9；c、通过PCR技术在EcCDA基因两端加上与D10A缺陷型Cas9蛋白基因两端同源的序列，并利用infusion无缝克隆试剂盒将EcCDA基因和D10A缺陷型Cas9蛋白基因进行连接，得到pnCas9-EcCDA重组质粒；d、将构建的pnCas9-EcCDA重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，筛选阳性克隆并进行扩大培养，利用质粒小提试剂盒提取重组质粒；e、利用XbaⅠ限制性内切酶将pnCas9-EcCDA重组质粒线性化，并通过体外转录试剂盒进行nCas9-EcCDAmRNA的体外转录；转录所得到的nCas9-EcCDAmRNA与目的编辑位点对应的gRNA共同构成所述的单碱基基因编辑系统。步骤a中，EcCDA基因扩增的上游引物如SEQIDNO.3所示，下游引物如SEQIDNO.4所示。步骤b中，所述的反向PCR引物为：p-D10A-F：如SEQIDNO.5所示；p-D10A-R：如SEQIDNO.6所示。上述构建的单碱基基因编辑系统的应用，具体为将nCas9-EcCDAmRNA和目的编辑位点对应的gRNA通过显微注射技术共注射到甲壳动物受精卵中，可以实现甲壳动物功能基因特定位点C→T的单碱基替换。本专利技术相对现有技术的有益效果在于：1、本专利技术提供了一种脊尾白虾胞苷脱氨酶(EcCDA)基因的全部编码序列，同时也提供了其所编码的氨基酸序列及其信号肽切割位点。2.本专利技术构建了EcCDA与D10A缺陷型Cas9蛋白的融合表达重组质粒(pnCas9-EcCDA)，并成功进行了体外转录，获得了nCas9-EcCDAmRNA。3.本专利技术利用显微注射技术将nCas9-EcCDAmRNA和目的编辑位点对应的gRNA共注射到甲壳动物受精卵，实现了甲壳动物功能基因特定位点的单碱基替换。4.本专利技术为研究甲壳动物SNP位点的功能提供了新的技术手段，有利于甲壳动物基因功能的研究，并对经济甲壳动物分子精准育种的实施和发展提供了基础。附图说明图1为EcCDA的核苷酸与编码氨基酸序列信息(上图)及SMART:Mainpage(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测的蛋白结构域(下图)。图2为中华锯齿米虾蜕皮抑制激素基因NdMIH靶向位点的单碱基编辑结果。其中，Wild为野生型样品测序峰图，M1-M5为单碱基编辑发生碱基转变的测序峰图。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术的技术效果进行详细阐述。本专利技术中未提及的实验方法和实验条件均为本领域技术人员公知的常规实验操作。实施例1nCas9-EcCDAmRNA的获取a、基因克隆：从脊尾白虾(购于青岛沙子口市场)cDNA文库中筛选到一种胞苷脱氨酶基因(EcCDA)(序列如SEQIDNO.1所示)，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。对其氨基酸序列进行结构域的预测，发现EcCDA氨基酸序列存在1个典型的胞苷脱氨酶结构域(dCMP_cyt_deam_1)。EcCDA基因的扩增体系为：其中，EcCDA-F序列如SEQIDNO.3所示，EcCDA-R序列如SEQIDNO.4所示。反应条件为：PCR产物进行1％凝胶电泳，切下目的条带并进行纯化。纯化产物连入pMD19-TVector，转化大肠杆菌DH5α感受态，长出菌落后进行菌落PCR，判断质粒是否成功转化；将阳性菌落进行sanger测序分析，获得EcCDA的准确cDNA序列；对应的菌液保种备用。b、突变Cas9蛋白RuvC结构域：Cas9蛋白的两个核酸酶结构域同时切断DNA分子两条链时，生物体会启动同源重组或非同源末端连接的修复机制，产生随机indels，不利于SNP位点的突变和研究。因此，本专利技术利用PCR引物设计，将Cas9蛋白RuvC结构域的第10位氨基酸由天冬氨酸突变为了丙氨酸(D10A)，使该结构域失活。这样Cas9蛋白就可以在gRNA序列引导下实现特定基因位点定位功能的同时，只切本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA基因，其特征是，所述基因的序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA基因，其特征是，所述基因的序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA基因，其特征是，所述基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种基于脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA的单碱基基因编辑系统，其特征是，所述单碱基基因编辑系统包含能够表达融合蛋白的mRNA和目的编辑位点对应的gRNA，所述融合蛋白包含D10A缺陷型Cas9蛋白和脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA，所述的脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA对应的基因序列如SEQIDNO.1所示。


4.一种权利要求3所述的单碱基基因编辑系统的构建方法，其特征是，包括以下步骤：
a、利用RACE技术，从脊尾白虾cDNA文库中克隆脊尾白虾胞苷脱氨酶EcCDA基因；
b、以pCMV-Cas9质粒为模板，利用反向PCR引物，将Cas9蛋白RuvC结构域的第10位氨基酸由天冬氨酸突变为丙氨酸，使RuvC结构域失活，从而得到含有D10A缺陷型Cas9蛋白基因的质粒pCMV-nCas9；
c、通过PCR技术在EcCDA基因两端加上与D10A缺陷型Cas9蛋白基因两端同源的序列，并利用infusion无缝克隆试剂盒将EcCDA基因和...

【专利技术属性】
技术研发人员：张继泉，刘玉洁，邢珂凡，孙玉英，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：河北;13