修饰型脂肪酶及其用途制造技术

本发明专利技术的课题在于提供一种高温下的稳定性和反应性优异的修饰型脂肪酶。一种修饰型脂肪酶，具有在序列号1的氨基酸序列中含有选自T130C‑S153C、A249P、F259Y、S282P、S283Y和S300P中的一个或两个以上的氨基酸取代的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示90％以上同源性的氨基酸序列，高温下的反应性和/或稳定性得到提高。

Modified lipase and its application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰型脂肪酶及其用途
本专利技术涉及修饰型脂肪酶。详细而言，本专利技术提供高温下的反应性和/或稳定性得到提高的修饰型脂肪酶及其用途。本申请主张基于2017年9月1日申请的日本专利申请第2017-168995号的优先权，该专利申请的全部内容通过参照而援引入本申请。
技术介绍
脂肪酶是作用于脂质中的酯键的酶。各种来源的脂肪酶被分离，用于油脂的分解、食品加工、医药品的制造等。例如来自于柱状假丝酵母(Candidacylindracea)的脂肪酶(以前称为来自于皱褶假丝酵母(Candidarugosa)的脂肪酶)有望用于废水处理、食品加工等领域中(例如参照专利文献1～3、非专利文献1)。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2012/077614号小册子专利文献2：日本特开2017-73980号公报专利文献3：日本特开2003-144162号公报非专利文献非专利文献1：赤井周二，以下一代型酶催化反应为目标的不对称合成反应的开发研究，YAKUGAKUZASSHI,Vol.123(2003)No.11.P919-931。
技术实现思路
来自于柱状假丝酵母的脂肪酶在产业上的有用性高。然而，该脂肪酶的高温下的稳定性和反应性存在改善的余地。如果高温下的稳定性/反应性得到改善则能够实现生产率的提高、用途的扩大。因此，本专利技术的课题在于改善来源于柱状假丝酵母的脂肪酶的高温下的稳定性/反应性，提高其有用性和利用价值。为了解决上述课题，本专利技术人等尝试修饰来源于柱状假丝酵母的脂肪酶。经过反复试验，成功确定了对高温下的反应性或稳定性的提高有效的突变点(氨基酸残基)，得到有用性高的突变体(修饰型脂肪酶)。该成果在提供用于设计、获取可实现高温下的反应性和稳定性的提高这样的目的的突变体的信息、手段方面也很重要。然而，通过组合二个有效的突变而产生相加或协同效果的可能性很高这种经验很多。另外，鉴于同种酶的结构(一级结构、立体结构)的相似性高、相同的突变产生相同的效果的几率高这样的技术常识，如果将来源于具有序列号1的氨基酸序列的柱状假丝酵母的脂肪酶中发现的有用突变应用于与该脂肪酶之间结构上相似性高的其它脂肪酶，则起到同等效果的几率高，并且本领域技术人员可认识到这样的应用是有效的。以下的专利技术基于以上的成果和考虑。[1]一种修饰型脂肪酶，具有在序列号1的氨基酸序列中含有选自T130C-S153C、A249P、F259Y、S282P、S283Y和S300P中的一种或两种以上的氨基酸取代的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示90％以上同源性的氨基酸序列，所述修饰型脂肪酶与由序列号1的氨基酸序列构成的脂肪酶相比，高温下的反应性和/或稳定性提高。[2]根据[1]所述的修饰型脂肪酶，其中，修饰型脂肪酶的氨基酸序列中含有的氨基酸取代是T130C-S153C或S283Y，高温下的反应性提高。[3]根据[1]所述的修饰型脂肪酶，其中，修饰型脂肪酶的氨基酸序列中含有的氨基酸取代为A249P、S283Y或S300P，高温下的稳定性提高。[4]一种脂肪酶，是序列号2～7中任一个氨基酸序列或与该氨基酸序列显示90％以上同源性的氨基酸序列(其中，同源性的基准为序列号2的氨基酸序列的情况下在130位半胱氨酸和153位半胱氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同，同源性的基准为序列号3的氨基酸序列的情况下在249位脯氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同，同源性的基准为序列号4的氨基酸序列的情况下在259位酪氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同，同源性的基准为序列号5的氨基酸序列的情况下在282位脯氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同，同源性的基准为序列号6的氨基酸序列的情况下在283位酪氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同，同源性的基准为序列号7的氨基酸序列的情况下在300位脯氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同)，所述脂肪酶与由序列号1的氨基酸序列构成的脂肪酶相比高温下的反应性和/或稳定性提高。[5]一种基因，编码[1]～[4]中任一项所述的修饰型脂肪酶。[6]根据[5]所述的基因，其中，含有序列号8～19中任一个碱基序列。[7]一种重组DNA，含有[5]或[6]所述的基因。[8]一种微生物，保有[7]所述的重组DNA。[9]根据[8]所述的微生物，其中，宿主是大肠杆菌、柱状假丝酵母、米曲霉、枯草芽孢杆菌或毕赤酵母菌。[10]一种酶制剂，含有[1]～[4]中任一项所述的修饰型脂肪酶。[11]一种油脂的分解法，其特征在于，使[1]～[4]中任一项所述的酶或[10]所述的酶制剂作用于油脂，进行酶反应。[12]根据[11]所述的分解法，其中，酶反应在30℃～70℃进行。[13]一种修饰型脂肪酶的制备法，包括以下的步骤(I)～(III)：(I)准备编码序列号2～7中任一个氨基酸序列的核酸的步骤；(II)表达上述核酸的步骤，以及(III)回收表达产物的步骤。附图说明图1是突变体的高温下的反应性。将相对活性(60℃的酶活性与30℃的酶活性的比率)与野生型酶进行比较。图2是突变体的高温下的稳定性。将在50℃下处理30分钟时的活性残存率与野生型酶进行比较。具体实施方式为了便于说明，对于与本专利技术相关而使用的术语的一部分作以下定义。(术语)术语“修饰型脂肪酶”是指将作为基准的脂肪酶(以下称为“基准脂肪酶”)修饰或突变而得到的酶。典型而言，基准脂肪酶是具有序列号1的氨基酸序列的来自于柱状假丝酵母(Candidacylindracea)的脂肪酶。术语“来自于柱状假丝酵母(Candidacylindracea)的脂肪酶”和术语“来自于皱褶假丝酵母(Candidarugosa)的脂肪酶”能够交换使用。术语“来自于柱状假丝酵母的脂肪酶”是指其起源是柱状假丝酵母的脂肪酶，包括柱状假丝酵母产生的脂肪酶或利用该脂肪酶的遗传信息而由其它微生物等表达的脂肪酶等。本专利技术中，作为修饰或突变，进行“氨基酸的取代”。因此，如果比较修饰型脂肪酶和基准脂肪酶，则发现部分氨基酸残基存在不同。应予说明，在本说明书中，将修饰型脂肪酶也称为修饰型酶或突变体。本说明书中根据惯例，如以下所示，用1个字母表述各氨基酸。蛋氨酸：M，丝氨酸：S，丙氨酸：A，苏氨酸：T，缬氨酸：V，酪氨酸：Y，亮氨酸：L，天冬酰胺：N，异亮氨酸：I，谷氨酰胺：Q，脯氨酸：P，天冬氨酸：D，苯丙氨酸：F，谷氨酸：E，色氨酸：W，赖氨酸：K，半胱氨酸：C，精氨酸：R，甘氨酸：G，组氨酸：H本说明书中，将信号肽被切断的成熟体的N末端的氨基酸残基作为第1位，从N末端朝向C末端通过附带的编号确定突变点的位置。本说明书中，用表示氨基酸种类的上述1个字母和表示氨基酸位置的数字的组合来表达突变点的氨基酸残基(作为取代对象的氨基酸残基)。例如如果是130位的苏氨酸被半胱氨酸取代的突变则表达为“T130C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种修饰型脂肪酶，具有在序列号1的氨基酸序列中含有选自T130C-S153C、A249P、F259Y、S282P、S283Y和S300P中的一个或两个以上的氨基酸取代的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示90％以上同源性的氨基酸序列，所述修饰型脂肪酶与由序列号1的氨基酸序列构成的脂肪酶相比，高温下的反应性和/或稳定性提高。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170901 JP 2017-1689951.一种修饰型脂肪酶，具有在序列号1的氨基酸序列中含有选自T130C-S153C、A249P、F259Y、S282P、S283Y和S300P中的一个或两个以上的氨基酸取代的氨基酸序列或与该氨基酸序列显示90％以上同源性的氨基酸序列，所述修饰型脂肪酶与由序列号1的氨基酸序列构成的脂肪酶相比，高温下的反应性和/或稳定性提高。


2.根据权利要求1所述的修饰型脂肪酶，其中，修饰型脂肪酶的氨基酸序列中含有的氨基酸取代为T130C-S153C或S283Y，高温下的反应性提高。


3.根据权利要求1所述的修饰型脂肪酶，其中，修饰型脂肪酶的氨基酸序列中含有的氨基酸取代为A249P、S283Y或S300P，高温下的稳定性提高。


4.一种脂肪酶，是序列号2～7中任一个氨基酸序列或与该氨基酸序列显示90％以上同源性的氨基酸序列，所述脂肪酶与由序列号1的氨基酸序列构成的脂肪酶相比高温下的反应性和/或稳定性提高，其中，同源性的基准为序列号2的氨基酸序列的情况下在130位半胱氨酸和153位半胱氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同，同源性的基准为序列号3的氨基酸序列的情况下在249位脯氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同，同源性的基准为序列号4的氨基酸序列的情况下在259位酪氨酸以外的位置产生氨基酸序列的不同，同源性的基准为序列号...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉田和典，高桥哲也，石川一彦，
申请(专利权)人：天野酶制品株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP