一种纳米疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种利用不饱和脂肪酸建立的包含抗原肽、免疫佐剂和小分子药物的多组分无载体一体化纳米疫苗及其方法。本发明专利技术的纳米疫苗，包括抗原，免疫佐剂和不饱和脂肪酸，所述抗原通过‑SH基团共价偶联不饱和脂肪酸，所述免疫佐剂通过S‑S键偶联不饱和脂肪酸。本发明专利技术利用不饱和脂肪酸修饰肿瘤靶向的抗原肽和免疫佐剂，在水溶液中以不饱和脂肪酸为疏水核心发生自组装，疏水核心内亦可装载疏水性强的小分子药物。该纳米疫苗可以提高抗原肽在淋巴结内的驻留时间，增加DC细胞对抗原肽的内吞，提高抗肿瘤免疫效果。

A nano vaccine and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种纳米疫苗及其制备方法
本专利技术涉及医药生物
，特别涉及疫苗
；具体涉及一种利用不饱和脂肪酸建立的包含抗原肽、免疫佐剂和小分子药物的多组分无载体一体化纳米疫苗。
技术介绍
随着人口老龄化等因素的加剧，我国癌症的发病率和死亡率持续上升，癌症已成为我国人群死亡主要原因，严重危害国人健康。近年来，抗肿瘤免疫疗法发展迅猛，尤其是免疫检查点抑制剂疗法(例如：PD-1抑制剂和CTLA-4抑制剂)在临床上取得了显著的疗效。免疫检查点抑制剂疗法的主要原理是通过抗体或小分子化合物阻断肿瘤细胞和效应T细胞(CTL)之间形成的免疫抑制性复合物(例如PD-1/PD-L1，CTLA-4/B7复合物)，进而解除CTL内的免疫抑制信号，重新启动CTL对肿瘤细胞的攻击。然而，免疫检查点抑制剂疗法也具有一定的局限性。首先，药物响应性在不同肿瘤种类间差异大。造成此差异的主要原因之一是由于突变负荷低的肿瘤会产生较少的肿瘤特异性抗原(TSA)，进而弱化了肿瘤细胞自发被免疫细胞识别的效率，阻碍了免疫检查点抑制剂疗法的广泛应用，同时也提示我们需要配合更好的肿瘤特异性抗原呈递方法以辅助免疫检查点抑制剂疗法。其次，在一些患者体内，免疫检查点抑制剂疗法的副作用(免疫相关性毒副反应)较为明显，包括皮肤瘙痒、皮疹、白癫风、腹泻、甚至肝损伤和心脏衰竭，这主要是免疫细胞对非肿瘤细胞的非特异性地攻击造成的。所以，在抗肿瘤免疫治疗过程中，高活性的、具有肿瘤靶向性的CTL的数量是提高抗肿瘤疗效、降低副作用的关键。CTL的活化主要依赖于抗原呈递细胞(AntigenPresentingCell,APC)，特别是具有交叉呈递作用的树突状细胞(Dendriticcell，DC)，它可将内吞得到的TSA通过MHCI呈递于细胞表面(交叉呈递)，特异性地激活CTL进行肿瘤杀伤。而且，DC在提呈抗原肽-MHC分子复合物的同时，能高表达协同刺激分子(costimulatingfactor)，直接提供双信号激活初始CD8+T细胞，使之表达分泌IL-2，促进自身增殖并分化为CTL。然而，DC细胞对于游离肽段的摄取率不高，且游离肽段的体内循环周期短，极大限制了抗肿瘤疫苗的效果。为解决此问题，抗肿瘤疫苗常伴随免疫佐剂(例如CpG-ODN、Montanide、R848)使用，以进一步刺激DC和CTL细胞，但免疫佐剂也会导致一些的副作用，例如注射部位的肌肉萎缩、流感样反应、头痛。因此，免疫佐剂给药方式的优化和创新也是抗肿瘤免疫领域的一个研究热点和难点。目前的免疫佐剂纳米药物主要是纳米载体包裹佐剂单药的形式，没有和肿瘤特异性抗原肽形成连接，不能保证同一个DC可以同时接受免疫佐剂和肿瘤特异性抗原肽，这会降低佐剂/肿瘤特异性抗原肽联用疗法的疗效，同时增加了免疫相关性毒副反应。为解决上述问题，本专利技术由此而来。
技术实现思路
本专利技术的目的在于改善现有技术中抗肿瘤疫苗免疫佐剂降低佐剂/肿瘤特异性抗原肽疗效及存在的副作用，提供一种利用不饱和脂肪酸对抗原肽和免疫佐剂进行化学修饰，利用无载体自组装技术将抗原肽、免疫佐剂和疏水的小分子药物装载于同一纳米颗粒的肿瘤疫苗，提高肿瘤抗原多肽疫苗的免疫效果。为了达到上述目的，本专利技术通过如下技术方案实现：一种纳米疫苗，其包括：抗原，免疫佐剂和不饱和脂肪酸，其特征在于，所述抗原通过共价键偶联不饱和脂肪酸，所述免疫佐剂通过共价键偶联同种类或不同种类不饱和脂肪酸。优选地，抗原选自不含半胱氨酸Cys的肽、蛋白、糖蛋白、糖肽、蛋白聚糖或其组合的形式。优选地，不含半胱氨酸Cys的抗原N端添加有Cys-(b)序列或Cys-(a)-(b)序列，其中，(a)为亲水性基团，(b)为组织蛋白酶的酶切位点基团。这个(a)序列是用来平衡整个抗原肽的亲水性的，如果后面的抗原肽亲水性差，就需要增加(a)亲水性基团，如果抗原肽本身亲水性好，就可以只有一个氨基酸甚至没有。优选地，所述(a)为不含半胱氨酸Cys的肽段，包括但不限于单个氨基酸，二肽或多肽；更优选地，所述(a)选自-Ser-基团、-Gly-基团、二肽–Ser-Ser-或-Ser-Gly-。所述b为选自组织蛋白酶A--Z中任一种的酶切位点的氨基酸序列，所述组织蛋白酶A–Z为现有技术已知的从A、B、C、D、E、F……X、Y、Z的组织蛋白酶。更优选地，(b)为选自组织蛋白酶B、F、H、K、L、S、V、B、C、H、X中任一种酶切位点氨基酸序列。本专利技术的一具体技术方案中，(b)为组织蛋白酶S的酶切位点，即–Val-Val-Arg-三肽，VVR有利于纳米颗粒被DC细胞内吞后，在溶酶体内的组织蛋白酶S的作用下断裂释放出模式抗原。优选地，所述免疫佐剂选自含有-OH的佐剂，更优选地，选自可激活DC细胞抗原呈递能力的化合物，包括但不限于：TLR信号通路激动剂，STING信号通路激动剂，且分子结构内部包含-OH基团的化合物；更优选地，免疫佐剂包括但不限于R848、CpG、咪喹莫特(Imiquimod)中的一种或多种。本专利技术的一具体技术方案中，所述抗原在N端修饰Cys-(b)序列或Cys-(a)-(b)序列后通过半胱氨酸Cys残基的-SH共价偶联不饱和脂肪酸，所述免疫佐剂通过S-S键偶联不饱和脂肪酸同种类或不同种类不饱和脂肪酸。更优选地，所述免疫佐剂的-OH通过S-S键偶联不饱和脂肪酸。优选地，所述不饱和脂肪酸选自：单不饱和脂肪酸或多不饱和脂肪，所述单不饱和脂肪酸选自油酸、芥酸、棕榈油酸、反式油酸中的一种或多种；多不饱和脂肪，选自亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸DHA中的一种或多种。优选地，所述纳米肿瘤疫苗还含有疏水性强的小分子药物。所述疏水性强的小分子药物选自调节DC细胞内信号通路的小分子药物中的一种或多种；包括但不限于：STAT3抑制剂stattic、Artesunate青蒿琥酯、C188-9。在一些具体实施方式中，抗原通过共价键偶联不饱和脂肪酸I，免疫佐剂通过共价键偶联同种类不饱和脂肪酸I。在一些具体实施方式中，抗原通过共价键偶联不饱和脂肪酸I，免疫佐剂通过共价键偶联同种类不饱和脂肪酸II。在一些具体实施方式中，抗原是当所述抗原为含有半胱氨酸Cys的抗原肽序列，应选择更换抗原肽序列，使其不含有Cys。本专利技术还提供上述纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：(1)准备抗原，(2)将N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺与不饱和脂肪酸通过缩合反应得到中间产物I，再将中间产物I和所述抗原通过迈克尔加成反应得到抗原共价偶联不饱和脂肪酸：(3)将2,2’-二硫二乙醇与不饱和脂肪酸通过酯化反应得到中间产物II，-不饱和脂肪酸-S-S-OH，将-不饱和脂肪酸-S-S-OH与对硝基氯甲酸苯酯反应得到中间产物III，中间产物III与免疫佐剂的通过酯交换反应得到终产物：免疫佐剂共价键偶联不饱和脂肪酸；(4)将步骤(2)得到的偶联不饱和脂肪酸的抗原、步骤(3)得到的偶联不饱和脂肪酸的免疫佐剂共同溶于一有机溶剂，充分混匀；(5)将步骤(4)得到的混合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米疫苗，其包括：抗原，免疫佐剂和不饱和脂肪酸，其特征在于，所述抗原通过共价键偶联不饱和脂肪酸，所述免疫佐剂通过共价键偶联同种类或不同种类不饱和脂肪酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种纳米疫苗，其包括：抗原，免疫佐剂和不饱和脂肪酸，其特征在于，所述抗原通过共价键偶联不饱和脂肪酸，所述免疫佐剂通过共价键偶联同种类或不同种类不饱和脂肪酸。


2.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，抗原为不含半胱氨酸Cys的肽、蛋白、糖蛋白、糖肽、蛋白聚糖或其组合的形式。


3.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，不含半胱氨酸Cys的抗原N端添加有Cys-(b)序列或Cys-(a)-(b)序列，其中，(a)为亲水性基团，(b)为组织蛋白酶的酶切位点基团。


4.根据权利要求3所述的纳米疫苗，其特征在于，所述(a)为不含半胱氨酸Cys的肽段，所述(a)选自-Ser-基团、-Gly-基团、二肽–Ser-Ser-或-Ser-Gly-。


5.根据权利要求3所述的纳米疫苗，其特征在于，所述(b)为选自组织蛋白酶A--Z中任一种的酶切位点氨基酸序列。


6.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于，所述抗原在N端修饰Cys-(b)序列或Cys-(a)-(b)序列后通过半胱...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔逸婷，郑树森，陈健翔，张乐乐，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33