一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法技术

本发明专利技术涉及医学检验技术领域，具体是一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法，采用液相质谱联用技术同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度，该方法包括：A、同时测定血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度。B、所有待测样品可在同一色谱和质谱条件下出峰测定。C、样品中不同极性待测物同时提取。优点：准确、简便、快速地评价患者体内血浆中腺苷浓度变化及其与服用抗血小板药物替格瑞洛后血浆中替格瑞洛及其活性代谢物浓度之间的关系。此外，本发明专利技术对预处理及色谱、质谱条件进行优化，使得测定方法操作简单、快速、灵敏、专属性强、重复性好。

A method for simultaneous determination of tegrarol, its active metabolites and endogenous adenosine in human plasma by LC-MS

【技术实现步骤摘要】
一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法
本专利技术涉及医学检验
，具体地说，是一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法。
技术介绍
替格瑞洛对血小板聚集具有双重作用机制，一方面可以通过抑制P2Y12受体，从而阻断磷酸腺苷(ADP)诱导血小板聚集，另一方面它可以抑制红细胞上ENT-1对腺苷再摄取而抑制血小板聚集。替格瑞洛除原型药物本身以外其活性代谢物AR-C124910XX同样可以有效抑制血小板聚集。这些药物特点，使得替格瑞洛在临床使用过程中，相对于阿司匹林和氯比格雷等其他抗血小板药物，可以明显降低心血管的死亡率，以及心血管事件导致的中风和死亡。腺苷对心血管产生的作用，包括血管舒张，抑制血小板聚集，抑制炎症，增加对缺血和再灌注的抵抗力。虽然腺苷对心血管产生很多有益作用，有研究报道静脉注射腺苷会诱导呼吸困难并有效抑制房室传导。[RiksenNP,RongenGA.Targetingadenosinereceptorsinthedevelopmentofcardiovas本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)标准样品制备：精密称取替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷，配制成腺苷浓度为110、55、11、5.5、3.3、2.2ng/mL；替格瑞洛浓度为1600、800、160、80、48、32ng/mL；替格瑞洛活性代谢物浓度为1108、554、110.8、55.4、33.2、22.2ng/mL的标准样品，所有溶液在4℃下保存，备用；/n(2)标准曲线血浆样本的制备：取空白人正常血浆，先加入稳定剂：赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤,双密达膜,外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP,乙二胺四...

【技术特征摘要】
1.一种液质联用同时测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)标准样品制备：精密称取替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷，配制成腺苷浓度为110、55、11、5.5、3.3、2.2ng/mL；替格瑞洛浓度为1600、800、160、80、48、32ng/mL；替格瑞洛活性代谢物浓度为1108、554、110.8、55.4、33.2、22.2ng/mL的标准样品，所有溶液在4℃下保存，备用；
(2)标准曲线血浆样本的制备：取空白人正常血浆，先加入稳定剂：赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤,双密达膜,外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP,乙二胺四乙酸，然后分别加入步骤(1)制得的标准样品，混匀，制成相应浓度的校正标样；
(3)待测血浆样本的制备：取全血样本加入含有肝素抗凝剂的样品管，立即加入稳定剂：赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤,双密达膜,外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP,乙二胺四乙酸，涡旋混匀，离心，分离血浆，得待测血浆样本；
(4)血浆样品预处理：取步骤(2)或(3)制得的血浆样本先加入内标D7-替格瑞洛和15N-腺苷，然后加入用50％-70％乙腈溶解的30％高氯酸，涡旋后再加入缓冲液调节pH，离心处理后取上清液；
(5)标准曲线制作：将步骤(2)得到的校正标样按照步骤(4)制备上清液样品提取物进行液质联用技术分析测定，分别以替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷浓度为横坐标，替格瑞洛及其活性代谢物和腺苷峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，制作标准曲线；
(6)定量分析：取待测全血样本，按照步骤(3)、(4)的方法处理后进行液质联用技术分析测定，并按照步骤(5)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度；
所述活性代谢物为AR-C124910XX。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：A：同一质谱离子源下同时测定待测血浆样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷的浓度；B：同一色谱条件下同时测定待测样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷色谱峰；C：同一样品预处理方法实现血浆样品中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷不同极性待测物的提取。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述A的测定方法为：用质谱中ESI源正离子MRM(多反应监测)模式，用于定量分析的离子对分别为m/z523.4→153.2(替格瑞洛)、m/z479.4→153.2(替格瑞洛活性代谢物)和m/z268.2→136.2(腺苷)；所述A的测定条件为：质谱条件为：喷雾电压为5.5kV，离子传输毛细管温度为650℃；Gas1(N2)压力为90Arb,Gas2(N2)压力为60Arb，帘气(N2)压力为28Arb；碰撞气(Ar)压力为Medium；DP电压分别为38eV(腺苷)、15eV(15N-腺苷)和70eV(替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢物和D7-替格瑞洛)；CE电压分别为25eV(腺苷)、15eV(15N-腺苷)和50eV(替格瑞洛、替格瑞洛活性代谢物和D7-替格瑞洛)；CXP电压分别为2.3eV；EP电压分别为4eV；正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(MRM)；用于定量分析的离子对分别为：m/z523.4→153.2(替格瑞洛)、m/z479.4→153.2(替格瑞洛活性代谢物)、m/z530.7→153.2(D7-替格瑞洛,IS)、m/z268.2→136.2(腺苷)和m/z269.1→137.1(15N-腺苷,IS)；扫描时间为0.2s。


4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述B的测定方法为：用C18分析柱和梯度洗脱，条件为：ZorbaxSB-AqC18column250×4.6mmI.D.,5μm色谱柱；流动相为甲醇-水含0.1％甲酸：0-4min：5：95(V/V)，4.1-10min：80：20(V/V)，10.1-20min：5：95(V/V)；流速为1ml/min，柱温为30℃。


5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述C的测定方法为：肝素抗凝的全血样本，立即加入稳定剂：赤-9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤,双密达膜,外切-5'-核苷酸酶α-β-亚甲基ADP,乙二胺四乙酸，混匀，加入用50％-70％乙腈溶解的30％高氯酸，涡旋后加入缓冲液调节pH，离心后取上清液进样。


6.权利要求1-5任一所述的方法在制备同时检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢物和内源性腺苷浓度的试剂盒中的应用。

【专利技术属性】
技术研发人员：王卓，张文静，高丽红，曹爱霖，许小建，仰先蜜，毕娟，杨云云，丁楠，邓敏，
申请(专利权)人：上海长海医院，
类型：发明
国别省市：上海;31