本发明专利技术属于GLP‑1检测技术领域，涉及一种利用高效液相色谱法检测GLP‑1或其类似物的方法。该方法使用流动相A和流动相B对含有GLP‑1或GLP‑1类似物的样品进行洗脱，所述流动相A为含有硫酸钠的乙腈水溶液，流动相B为乙腈水溶液。本发明专利技术提供的方法通过设置特定的流动相，可以减小基线波动，从而提高检测灵敏度，提高主峰和杂质的分离效果，更有效地控制GLP‑1产品或GLP‑1类似物产品的质量。
A method for the determination of GLP-1 or its analogues by high performance liquid chromatography
【技术实现步骤摘要】
利用高效液相色谱法检测GLP-1或其类似物的方法
本专利技术涉及GLP-1检测
，具体涉及一种利用高效液相色谱法检测GLP-1或其类似物的方法。
技术介绍
胰高血糖素样肽-1(本专利技术简称GLP-1)是一种由胃肠内分泌细胞产生的肽类物质，属于一种肠促胰岛素，能够通过多种途径来控制血糖。重组GLP-1为GLP-1类似物，在生产及储存过程中会产生多种产品相关杂质，较难分离。目前用于检测多肽类物质的流动相多为三氟乙酸体系，三氟乙酸流动相的主要缺陷是基线波动大，导致灵敏度低，不易检测到含量较小的杂质。并且在以三氟乙酸为流动相分离GLP-1或GLP-1类似物时，包含的杂质较多，分离效果不理想，无法很好的控制产品的质量。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种利用高效液相色谱法(本专利技术简称HPLC)检测GLP-1或其类似物的方法，以减小基线波动，从而提高检测方法的灵敏度，提高主峰和杂质的分离效果，更有效地控制GLP-1产品或GLP-1类似物产品的质量。本专利技术提供一种利用HPLC检测GLP-1或其类似物的方法，该方法使用流动相A和流动相B对含有GLP-1或GLP-1类似物的样品进行洗脱，所述流动相A由钠盐溶液和有机溶剂组成，流动相B由有机溶剂和水溶液组成；其中钠盐选自硫酸钠、氯化钠、乙酸钠和磷酸钠溶液中的一种或两种，有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈中的一种或两种。作为本专利技术的优选实施方案，所述流动相A中的钠盐为硫酸钠，所述流动相A中硫酸钠的浓度为10～50g/L，优选为15～40g/L，进一步优选为20～35g/L，更优选为23～28g/L，更优选为25～26g/L。本专利技术通过优化硫酸钠在流动相A中的比例，降低基线波动，提高检测GLP-1或GLP-1类似物的灵敏度，提高GLP-1产品或GLP-1类似物主峰与杂质的分离度。作为本专利技术的优选实施方案，所述流动相A中的有机溶剂为乙腈，所述流动相A中乙腈的体积百分比为5％～20％，优选为10％～15％，例如10％。通过优化乙腈在流动相A中的比例，降低基线波动，提高检测GLP-1或GLP-1类似物的灵敏度，提高GLP-1产品或GLP-1类似物主峰与杂质的分离度。作为本专利技术的优选实施方案，所述流动相A的pH值为2.0～4.5，优选为2.5～3.5，更优选为3。缓冲液缓冲能力强，能够提供稳定的pH，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形。作为本专利技术的优选实施方案，所述流动相A的pH值的调节剂为磷酸缓冲溶液。作为本专利技术的优选实施方案，所述流动相B中有机溶剂为乙腈，所述流动相B中乙腈的体积分数为60％～80％，优选为70％。通过优化乙腈在流动相B中的比例，降低基线波动，提高检测GLP-1或GLP-1类似物的灵敏度，提高GLP-1产品或GLP-1类似物主峰与杂质的分离度。作为本专利技术的优选实施方案，所述洗脱为梯度洗脱。作为本专利技术的更优选实施方案，所述梯度洗脱的方式为：以流动相A和流动相B的总体积为100％，所述流动相A所占的体积百分比由80％递减至30％，余量为流动相B。作为本专利技术的更优选实施方案，所述梯度洗脱的方式为：以流动相A和流动相B的总体积为100％；0～8分钟，所述流动相A的体积百分比由80％递减至65.5％，余量为流动相B；8～29分钟，所述流动相A的体积百分比保持65.5％，余量为流动相B；29～32分钟，所述流动相A的体积百分比由65.5％递减至30％，余量为流动相B；32～40分钟，所述流动相A的体积百分比保持30％，余量为流动相B。作为本专利技术的优选实施方案，所述洗脱所使用的色谱柱为C18柱，优选为WatersX-selectCSHC18填充柱。增加对GLP-1或GLP-1类似物的选择性，提高对GLP-1或GLP-1类似物的分离效率。作为本专利技术的优选实施方案，所述高效液相色谱法的色谱柱柱温为35～45℃。作为本专利技术的优选实施方案，所述含有GLP-1或GLP-1类似物的样品的进样体积为1～10μL，优选为4～6μL，例如5μL。作为本专利技术的优选实施方案，所述高效液相色谱法的流动相流速为0.5～5mL/min，优选为1～2mL/min。作为本专利技术的优选实施方案，所述高效液相色谱法的检测波长为210～218nm；优选为214nm。通过对色谱柱柱温、进样体积、流动相流速等优化，分离出更多的杂质，提高检测方法的灵敏度，更有效地控制GLP-1产品或GLP-1类似物产品的质量。作为本专利技术的优选实施方案，所述GLP-1或其类似物选自GLP-1(1-37)、利拉鲁肽中间体、艾塞那肽、阿必鲁肽、利司那肽。所述GLP-1(1-37)的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。具体为：HNEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。所述利拉鲁肽中间体为含有31个氨基酸的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。具体为：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG。所述艾塞那肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。所述阿必鲁肽的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR。所述利司那肽的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK。本专利技术提供的利用高效液相色谱检测GLP-1或其类似物的方法，通过设置流动相A为含有硫酸钠的乙腈水溶液，流动相B为乙腈水溶液，相对于现有的以三氟乙酸体系等为流动相的高效液相色谱法，减小基线波动，提高灵敏度，提高GLP-1产品或GLP-1类似物产品主峰与杂质的分离度，更有效地控制GLP-1产品或GLP-1类似物产品的质量。。本专利技术提供的利用高效液相色谱检测GLP-1或其类似物的方法，GLP-1或GLP-1类似物的检测限为0.5μg/ml，定量限为1μg/ml。附图说明图1为色谱柱ACEC18与WatersX-bridgeC18的检测结果对比图。其中1代表ACEC18；2代表WatersX-bridgeC18。图2为色谱柱WatersX-bridgeC18与WatersX-selectC18的检测结果对比图。其中2代表WatersX-bridgeC18；3代表WatersX-selectC18。图3为硫酸钠分别浓度为0.1M和0.2M的检测结果对比图。图4为流动相A的pH2.0和pH3.0的检测结果对比图。图5为流动相A的pH3.0和pH3.5的检测结果对比图。图6为不同色谱柱柱温的检测结果对比图。图7为流动相B分别为50％ACN和70％CAN的检测结果对比图。图8为实施例6中检测利拉鲁肽中间体的色谱图。图9为实本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用高效液相色谱法检测GLP-1或其类似物的方法，该方法使用流动相A和流动相B对含有GLP-1或GLP-1类似物的样品进行洗脱，其特征在于，所述流动相A由钠盐溶液和有机溶剂组成，流动相B由有机溶剂和水溶液组成；/n所述钠盐选自硫酸钠、氯化钠、乙酸钠和磷酸钠溶液中的一种或两种，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈中的一种或两种。/n
【技术特征摘要】
1.一种利用高效液相色谱法检测GLP-1或其类似物的方法，该方法使用流动相A和流动相B对含有GLP-1或GLP-1类似物的样品进行洗脱，其特征在于，所述流动相A由钠盐溶液和有机溶剂组成，流动相B由有机溶剂和水溶液组成；
所述钠盐选自硫酸钠、氯化钠、乙酸钠和磷酸钠溶液中的一种或两种，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、异丙醇和乙腈中的一种或两种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A中的钠盐为硫酸钠，所述流动相A中硫酸钠的浓度为10～50g/L，优选为15～40g/L，进一步优选为20～35g/L，更优选为23～28g/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述流动相A中的有机溶剂为乙腈，所述流动相A中乙腈的体积百分比为5％～20％，优选为10％～15％。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述流动相A的pH值为2.0～4.5，优选为2.5～3.5；
优选地，调节所述流动相A的pH值的调节剂为磷酸缓冲溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相B中有机溶剂为乙腈，所述流动相B中乙腈的体积分数为60％～80％，优选为70％。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱为梯度洗脱；
优选地，所述梯度洗脱的方式为...
【专利技术属性】
技术研发人员：潘兰，冯艳，张均，龚庆伟，蒋燕，李康，高相雷，郭林峰，李晓平，陈小锋，李文佳，
申请(专利权)人：东莞市东阳光生物药研发有限公司，广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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