毕赤酵母宿主蛋白残留的检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提出一种宿主蛋白残留的检测试剂盒。该试剂盒包括：多克隆抗体以及任选的生物标记的多克隆抗体，所述多克隆抗体特异性识别所述宿主蛋白，其中，所述多克隆抗体是通过如下方式获得的：利用抗原对第一待免疫动物进行主动免疫，以便获得第一含有抗体的血清；利用所述第一含有抗体的血清对第二待免疫动物进行被动免疫，以便获得第二含有抗体的血清；将含有第二抗体的血清进行纯化处理，以便获得第二抗体，所述多克隆抗体包括所述第二抗体。利用根据本发明专利技术实施例的试剂盒检测生物药产品中的宿主蛋白的残留，灵敏度和准确度均显著提高。

【技术实现步骤摘要】
毕赤酵母宿主蛋白残留的检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及毕赤酵母宿主蛋白残留的检测试剂盒以及检测待测样品中毕赤酵母宿主蛋白残留的方法。
技术介绍
市面上的重组蛋白酶系由工程菌重组表达，经纯化得到重组蛋白酶。但所获得的重组蛋白酶会有宿主蛋白残留的风险，按照ICHQ6B的管理规定，宿主蛋白是生物药产品的工艺相关杂质，需要建立适合的检测方法进行严格控制。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种宿主蛋白残留的检测试剂盒。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒包括：多克隆抗体以及任选的生物标记的多克隆抗体，所述多克隆抗体特异性识别所述宿主蛋白，其中，所述多克隆抗体是通过如下方式获得的：利用抗原对第一待免疫动物进行主动免疫，以便获得第一含有抗体的血清；利用所述第一含有抗体的血清对第二待免疫动物进行被动免疫，以便获得第二含有抗体的血清；将含有第二抗体的血清进行纯化处理，以便获得第二抗体，所述多克隆抗体包括所述第二抗体。根专利技术人发现，上述方法所获得的多克隆抗体的覆盖率，相比于现有技术，显著提高。利用根据本专利技术实施例的试剂盒检测生物药产品中的宿主蛋白的残留，灵敏度和准确度均显著提高。根据本专利技术的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：根据本专利技术的实施例，上述制备抗体的方法进一步包括将第一含有抗体的血清进行纯化处理，以便获得第一抗体；将第一抗体与所述第二抗体混合，以便获得所述多克隆抗体。进而抗体的覆盖率进一步提高。根据本专利技术的实施例，所述抗原为细胞全蛋白HCPs。根据本专利技术的具体实施例，所述抗原为发酵工程菌HCPs。根据本专利技术的具体实施例，所述抗原为毕赤酵母HCPs。根据本专利技术的具体实施例，所述第一待免疫动物和/或第二待免疫动物为新西兰大白兔。根据本专利技术的实施例，所述发酵工程菌HCPs是通过如下方式获得的：将携带空载体的发酵工程菌进行发酵处理，以便使发酵工程菌的OD600至少达到400，优选地，不超过600，发酵液作为免疫原1(包括发酵上清和菌体)，将发酵液上清作为免疫原2，将发酵工程菌菌体作为免疫原3；将发酵液进行亲和层析处理，层析处理液作为免疫原4。专利技术人在抗体制备过程中，模拟工程菌发酵产品的生产工艺，采用携带空载载体的发酵工程菌进行发酵，以获得免疫原。专利技术人发现，将发酵过程后上述四种免疫原分别作为免疫原免疫个体，再把获得的抗体混合，相比上述任意一种单一免疫原作为免疫原免疫个体，获得的抗体，其覆盖率进一步显著提高。根据本专利技术的具体实施例，所述发酵液进行亲和层析处理是通过如下方式进行的：采用博格隆的EzFastproteinADiamond亲和层析柱，偶联约10～30mg的抗含pPIC9K空白载体的PichiaPastoris细胞全蛋白HCPs的多克隆抗体，然后再上样1～1.5mg的含pPIC9K空白载体的PichiaPastoris细胞全蛋白HCPs，收集其穿透液，即为所需的免疫原4。根据本专利技术的具体实施例，进一步包括分别将所述免疫原1、免疫原2、免疫原3以及免疫原4与弗氏完全佐剂等体积混合，以便获得免疫原混合液1、免疫原混合液2、免疫原混合液3以及免疫原混合液4。弗氏完全佐剂是一种油包水的乳浊液，含结核分枝杆菌的细胞壁成分。佐剂活性来自于油滴中免疫原的持续释放，并刺激局部免疫反应。根据本专利技术的具体实施例，进一步包括分别将所述免疫原1、免疫原2、免疫原3以及免疫原4与弗氏不完全佐剂等体积混合，以便获得免疫原混合液A、免疫原混合液B、免疫原混合液C以及免疫原混合液D。弗氏不完全佐剂不含结核分枝杆菌成分。根据本专利技术的实施例，所述主动免疫是通过如下方式进行的：分别利用所述免疫原混合液1、免疫原混合液2、免疫原混合液3以及免疫原混合液4对所述第一待免疫动物的四个个体进行初始免疫；每隔7～10天，分别利用所述免疫原混合液A、免疫原混合液B、免疫原混合液C以及免疫原混合液D对所述第一待免疫动物的四个个体进行加强免疫。采用包含弗氏完全佐剂的免疫原混合液对动物进行初始免疫，而采用含弗氏不完全佐剂的免疫原混合液对动物进行加强免疫，一方面有效刺激了局部免疫反应，另一方面有效减少了副作用。根据本专利技术的实施例，进行被动免疫前，进一步包括将所述第一含有抗体的血清进行稀释处理。具体地，所述稀释处理的倍数为2～4倍，优选地，稀释3倍。根据本专利技术的实施例，将第一次和第二次加强免疫后所获得的血清合并后，以便获得被动免疫用血清A、被动免疫用血清B、被动免疫用血清C以及被动免疫用血清D。专利技术人发现，采用第一次和第二次加强免疫后所获得的血清，合并作为后续被动免疫用血清，可进一步提高抗体的覆盖率。根据本专利技术的实施例，所述被动免疫是通过如下方式进行的：分别利用被动免疫用血清A、被动免疫用血清B、被动免疫用血清C以及被动免疫用血清D对所述第二待免疫动物的四个个体进行初始免疫；每隔7～10天，分别利用所述被动免疫用血清A、被动免疫用血清B、被动免疫用血清C以及被动免疫用血清D对所述第二待免疫动物的四个个体进行加强免疫。根据本专利技术的实施例，当血清中抗体滴度至少达到50万时，优选地，不超过400万时，分别对第一含有抗体的血清和第二含有抗体的血清进行纯化处理。根据本专利技术的实施例，所述抗原与所述第一待免疫动物个体的质量比1:1～3:2(μg/g)。根据本专利技术的实施例，所述第一含有抗体的血清与所述第二待免疫动物个体的体积质量比为1:20～1:90(ml/kg)。根据本专利技术的实施例，所述试剂盒进一步包括抗体稀释液、样品稀释液、reagentA、reagentB或PBST溶液。具体地，所述抗体稀释液为碳酸钠和碳酸氢钠的水溶液，所述抗体稀释液的pH为9.5～9.7。具体地，所述样品稀释液为BSA(牛血清蛋白)的水溶液，所述样品稀释液的pH为7.2～7.4；具体地，所述reagentA为Streptavidin(链霉亲和素)；具体地，所述reagentB为Biotin-HRP(辣根过氧化物酶HRP标记的生物素)；具体地，所述PBST溶液为PBS和吐温-20的水溶液。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种检测待测样品中宿主蛋白残留的方法。根据本专利技术的实施例，利用前面所述的试剂盒，对待测样品按照预定操作进行孵育处理；将孵育处理后的待测样品进行酶标检测，以便获得吸光值；基于所获得的吸光值以及吸光值-蛋白浓度标准曲线，获得所述待测样品中的宿主蛋白残留量。根据本专利技术实施例的方法检测待测样品中的宿主蛋白残留量，重复性好、准确度高。根据本专利技术的实施例，所述对待测样品按照预定操作进行孵育处理包括：(1)利用多克隆抗体对酶标板进行覆盖处理；(2)利用封闭液对覆盖处理后的酶标板进行封闭处理；(3)将待测样品加入封闭处理后的酶标板中进行第一孵育处理；(4)将第一孵育处理后的酶标板进行第一清洗处理；(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种宿主蛋白残留的检测试剂盒，其特征在于，包括：/n多克隆抗体以及任选的生物标记的多克隆抗体，所述多克隆抗体特异性识别所述宿主蛋白；/n其中，所述多克隆抗体是通过如下方式获得的：/n利用抗原对第一待免疫动物进行主动免疫，以便获得第一含有抗体的血清；/n利用所述第一含有抗体的血清对第二待免疫动物进行被动免疫，以便获得第二含有抗体的血清；/n将含有第二抗体的血清进行纯化处理，以便获得第二抗体，所述多克隆抗体包括所述第二抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种宿主蛋白残留的检测试剂盒，其特征在于，包括：
多克隆抗体以及任选的生物标记的多克隆抗体，所述多克隆抗体特异性识别所述宿主蛋白；
其中，所述多克隆抗体是通过如下方式获得的：
利用抗原对第一待免疫动物进行主动免疫，以便获得第一含有抗体的血清；
利用所述第一含有抗体的血清对第二待免疫动物进行被动免疫，以便获得第二含有抗体的血清；
将含有第二抗体的血清进行纯化处理，以便获得第二抗体，所述多克隆抗体包括所述第二抗体。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括将第一含有抗体的血清进行纯化处理，以便获得第一抗体；
将第一抗体与所述第二抗体混合，以便获得所述多克隆抗体。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原为细胞全蛋白HCPs，任选地，所述抗原为发酵工程菌HCPs，任选地，所述抗原为毕赤酵母HCPs，任选地，所述第一待免疫动物和/或第二待免疫动物为新西兰大白兔。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，进行被动免疫前，进一步包括将所述第一含有抗体的血清进行稀释处理，任选地，所述稀释处理的倍数为2～4倍，优选地，3倍。


5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，当血清中抗体滴度至少达到50万时，分别对第一含有抗体的血清和第二含有抗体的血清进行纯化处理；
优选地，血清中抗体滴度不超过400万。


6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原与所述第一待免疫动物个体的质量比1:1～3:2。


7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一含有抗体的血清与所述第二待免疫动物个体的体积质量比为1:20～1:90。


8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括抗体稀释液、样品稀释液、reagentA、reagentB或PBST溶液；
任选地，所述抗体稀释液为碳酸钠和碳酸氢钠的水溶液，所述抗体稀释液的pH为9.5～9.7；
任选地，所述样品稀释液为BSA的水溶液，所述样品稀释液的pH为7.2～7.4；
任选地，所述reagentA为Streptavidin；
任选地，所述reagentB为Biotin-HRP；
任选地，所述PBST溶液为PBS和吐温-20的水溶液。


9.一种检测待测样品中毕赤酵母宿主蛋白残留的方法，其特征在于，利用权利要求1～8任一项所述的试剂盒，对待测样品按照预定操作进行孵育处理；
将孵育处理后的待测样品进行酶标检测，以便获得吸光值；
基于所获得的吸光值以及吸光值-蛋白浓度标准曲线，获得所述待测样品中的宿主蛋白残留量。
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘国良，唐爽，郭林峰，谢灿，冯艳，徐军，李晓平，陈小锋，李文佳，
申请(专利权)人：东莞市东阳光生物药研发有限公司，广东东阳光药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44